1.โครงการสถานภาพงานวิจัย
ด้านเทคโนโลยีชีวภาพกับการปรับปรุงระบบการสังเคราะห์แสงภายใต้สภาวะโลกร้อน

 

 

2. ชื่อหัวหน้าโครงการ

(ไทย) รศ.ดร.อภิชาติ วรรณวิจิตร
(อังกฤษ) Apichart Vanavichit
ตำแหน่ง รองศาสตราจารย์
สถานที่ติดต่อ ศูนย์วิทยาศาสตร์ข้าว มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ วิทยาเขตกำแพงแสน จังหวัดนครปฐม
โทรศัพท์ 034-355192-4 โทรสาร 034-355197 E-mail This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

 

3.วัตถุประสงค์

3.1 เพื่อศึกษารวบรวมงานวิจัย ทั้งที่ได้รับและยังไม่ได้รับการตีพิมพ์ที่เกี่ยวกับปัญหาและแนวทางการปรับปรุงระบบการสังเคราะห์แสงภายใต้สภาวะโลกร้อ
3.2 รวบรวมห้องปฏิบัติการที่ทำงานวิจัยที่เกี่ยวข้องรวมทั้งสมาชิกในห้องปฏิบัติการและกิจกรรมวิจัยที่แต่ละคนทำอยู่ โครงการวิจัยที่ดำเนินอยู่ และ cutting edge technology ของห้องปฏิบัติการ
3.3 วิเคราะห์ผลงานวิจัย เรียบเรียงเป็นเอกสารวิชาการ
3.4 ทำ Roadmap โครงการวิจัยที่ควรให้การสนับสนุน เพื่อทำให้ประเทศไทยได้สร้างขีดความสามารถในงานวิจัยด้านนี้

 

 

4. เป้าหมาย

4.1 รายงานเอกสารวิชาการโดยสามารถรวบรวมผลงานวิจัยที่มีการตีพิมพ์ในช่วง 3 ปีแรก (2552-2554)ได้ถึง 80% และอุปสรรคความก้าวหน้าในงานวิจัยเกี่ยวกับสภาพงานวิจัยในปัจจุบัน
4.2 จัดทำ Laboratory Profile ของห้องปฏิบัติการที่มีผลงานด้านการศึกษาผลกระทบสภาวะโลกร้อนกับการผลิตข้าว
4.3 รายงานแผนงานวิจัยที่ทำให้ประเทศไทย ก้าวไปสู่ความสำเร็จ
4.4 จัดทำ Background และความชำนาญของนักวิจัยที่จะสามารถดำเนินงานวิจัยให้บรรลุผล

 

 

5. ของเขตการดำเนินงานการ

5.1 รวบรวม/ค้นหาข้อมูลงานวิจัยทั้งในรูปวารสารและงานวิจัยที่เกี่ยวข้องในหัวข้อเรื่องผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงภูมิอากาศโลกกับสิ่งแวดล้อม ที่มีผลกระทบต่อผลผลิตของข้าวไทยและประเทศในเขตลุ่มแม่น้ำโขงตอนล่าง
5.2 รวบรวม/ค้นหาข้อมูลงานวิจัยทั้งในรูปวารสารและงานวิจัยที่เกี่ยวข้องในหัวข้อเรื่องประสิทธิภาพการสังเคราะห์แสงภายใต้สภาวะโลกร้อน โดยมีรายละเอียดดังนี้

5.2.1 จุดอ่อนของระบบการสังเคราะห์แสง (Photosystem, PS) แบบ C3ภายใต้สภาวะโลกร้อนเปรียบเทียบกับพืชแบบ C4 และ CAM
5.2.2 การยับยั้งการสังเคราะห์แสง (Photoinhibition)
5.2.3 การหายใจในเวลากลางวัน (Photorespiration)
5.2.4 การพัฒนาระบบกลุ่มเซลล์เฉพาะทาง Kranz Anatonny

5.3 รวบรวม/ค้นหาข้อมูลงานวิจัยทั้งในรูปวารสารและงานวิจัยที่เกี่ยวข้องในหัวข้อเรื่องการปรับปรุงพันธุ์ข้าวเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการสังเคราะห์แสงภายใต้สภาวะโลกร้อน โดยมีรายละเอียดดังนี้

5.3.1 การปรับปรุงพันธุ์เพื่อลดสภาวะ Photoinhibition
5.3.2 การปรับปรุงพันธุ์เพื่อลดสภาวะ Photorespiration
5.3.3 พันธุวิศวกรรมในการเปลี่ยนข้าว C3 ไปเป็น C4

5.4 ระดมความคิดเห็นเชิงปฏิบัติการเพื่อให้เกิดความตระหนักในหมู่นักวิจัยไทยว่าจะต้องทำงานวิจัยอย่างไรจึงจะรักษาระดับผลผลิตเอาไว้ได้เมื่ออุณหภูมิสูงขึ้น รวมทั้งการตีพิมพ์บทความวิจัยเป็นบทความเชิงสรุปในวารสารงานวิจัยในประเทศไทย และการเผยแพร่บทความในเวปไซต์ของสำนักงานพัฒนาการวิจัยการเกษตร และเวปไซต์ของศูนย์วิทยาศาสตร์ข้าว โดยทำเป็น E-book เพื่อสะดวกในการสืบค้นข้อมูล

5.5 จัดทำรายงาน สรุปข้อคิดเห็น และข้อเสนอแนะจากโครงการต่อ สวก.
5.6 ให้บริการแก่ สวก. กรณีที่ สวก. ประสงค์ขอความร่วมมือสืบค้นตรวจสอบข้อเสนอโครงการ(ถ้ามี) และตรวจสอบการประดิษฐ์จากผลงานวิจัย สวก.(ถ้ามี)

 

 

 

ผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงภูมิอากาศโลกกับสิ่งแวดล้อม
มีผลกระทบต่อผลผลิตของข้าวไทยและประเทศในลุ่มแม่น้ำโขงตอนล่าง

 

ในสภาวะที่การเปลี่ยนแปลงทางภูมิอากาศ และภูมิประเทศเกิดขึ้นอย่างรวดเร็วและรุนแรง ได้มีการคาดการณ์ถึงผลกระทบต่อการเกษตรของไทยและประเทศเพื่อนบ้านในเขตลุ่มแม่น้ำโขงว่า จะมีผลกระทบอย่างกว้างขวางในหลาย ๆ ด้าน เช่น ความสมบูรณ์พันธุ์และผลผลิตทางการเกษตร การระบาดของแมลงศัตรูพืชอย่างรุนแรงจากการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิและสมดุลธรรมชาติที่เสื่อมโทรม การเกิดน้ำท่วมหรือแห้งแล้งอย่างฉับพลัน ตัวอย่างที่เห็นได้ชัดคือ สภาวะโลกร้อนในปัจจุบันได้เริ่มส่งผลกระทบต่อผลผลิตทางการเกษตรแล้ว โดยใช้ข้อมูลอากาศระหว่างปี 1979-2003 ของสถาบันวิจัยข้าวนานาชาติ โดยใช้simulation program พบว่า อุณหภูมิเฉลี่ยจากสูงสุดกับต่ำสุดประจำปี เพิ่มขึ้น0.35°C และ 1.13°C ตามลำดับ และผลผลิตเฉลี่ยข้าวลดลง10เท่าทุกๆอุณหภูมิ1°Cที่อุณหภูมิต่ำสุด(อุณหภูมิกลางคืน)เพิ่มขึ้นในฤดูนาปรัง ในขณะที่อุณหภูมิเฉลี่ยสูงสุดกลับไม่สำคัญในช่วงเวลาที่ผ่านมา (Peng et al., 2004) แต่อย่างไรก็ตามสภาวะโลกร้อนที่จะเกิดขึ้นในอนาคตค่าเฉลี่ยอุณหภูมิสูงสุดที่กำลังจะทะลุ 42°C ซึ่งก็จะกระทบกับพัฒนาการของข้าวโดยเฉพาะระยะผสมเกสรและพัฒนาเมล็ด และจะส่งผลกระทบอย่างรุนแรงมากในทศวรรษหน้า คือ เมื่ออุณหภูมิได้พุ่งทะยานขึ้นกว่า 45 องศาเซลเซียส ซึ่งจะส่งผลกระทบที่เห็นได้ในระยะอันใกล้นี้ คือปัญหาการผสมเกสรในช่วงฤดูร้อน และ/หรือปัญหาการสะสมน้ำหนักแห้งและคุณภาพเมล็ดภายใต้อุณหภูมิสูงเฉียบพลัน นอกจากนี้อุณหภูมิโลกที่สูงขึ้นจะส่งผลโดยตรงต่อการเติบโตและการกระจายขยายพันธุ์ของแมลงศัตรูพืชให้มีประชากรเพิ่มขึ้นได้อย่างรวดเร็ว อุณหภูมิสูงยังส่งผลให้การกระจายของโรคพืชเกิดได้ดีขึ้นด้วยเช่นกัน ด้วยเหตุนี้ การปรับปรุงพันธุ์พืชในปัจจุบันจึงจำเป็นต้องรวบยอดยีนที่ควบคุมความต้านทานต่อโรค-แมลงและความทนทานต่อการเปลี่ยนแปลงสภาพภูมิอากาศแบบฉับพลันเข้าไว้ในจีโนมของพืชพันธุ์ใหม่ให้ได้

 

 

 

ความท้าทาย

ความสำเร็จของการปรับปรุงพันธุ์ย่อมขึ้นอยู่กับความสามารถในการค้นหาความหลากหลายของพันธุกรรมที่มีอยู่ การผสมข้ามสายพันธุ์และการคัดเลือกที่มีประสิทธิภาพสูง ในสภาวะโลกร้อนที่การเปลี่ยนแปลงทางภูมิอากาศและภูมิประเทศจะเกิดขึ้นอย่างรวดเร็วและรุนแรง เป็นที่คาดการณ์ว่าพันธุ์พืช/สัตว์ที่ได้รับการปรับปรุงพันธุ์ในปัจจุบันกำลังถูกท้าทายอย่างหนัก ว่าจะมีความสมบูรณ์พันธุ์ดังเดิมหรือไม่ หากมองย้อนกลับไปสู่ยุคโบราณจะพบว่า การเปลี่ยนแปลงผิวโลกและบรรยากาศได้เกิดขึ้นหลายครั้ง จึงมีความเป็นไปได้ว่า พืช/สัตว์ตามธรรมชาติที่มีอยู่ในปัจจุบันอาจจะยังคงรักษายีนต้านทานเหล่านี้อยู่ ดังนั้นการค้นหาความหลากหลายทางชีวภาพที่ซ่อนอยู่ในจีโนมโดยเฉพาะในพันธุ์ป่า (wild type) น่าจะเป็นเป้าหมายแรกที่นักปรับปรุงพันธุ์จะต้องดำเนินการ การใช้ประโยชน์จาก Functional Genomics (FG) ซึ่งเป็นศาสตร์ที่มุ่งเน้นการหาความหลากหลายและหน้าที่ของยีนในระดับจีโนม (ในสิ่งมีชีวิตชั้นสูงจะมียีนอยู่ประมาณ 30,000 ชนิด) เป็นวิธีการที่ได้รับการยอมรับในปัจจุบัน นักปรับปรุงพันธุ์อาจใช้ FG ในการเปิดเผยให้เห็นถึงยีนที่แสดงออกที่อับละอองเรณู จนสามารถแก้ไขความเป็นหมันที่อุณหภูมิสูงได้ ยีนอื่น ๆ ที่มีความสำคัญเช่น ยีนที่ควบคุมการสะสมน้ำตาลและแป้งที่ทนต่ออุณหภูมิสูงได้ ยีนที่ควบคุมการสร้าง heat shock protein (HSP) หรือโปรตีนที่สร้างขึ้นเมื่อสิ่งมีชีวิตประสบกับสภาพอุณหภูมิวิกฤติ นักปรับปรุงพันธุ์จะต้องให้ความสนใจกับความหลากหลาย การทำงานและบทบาทของยีนแต่ละชนิดเหล่านี้ นอกจากนี้การปรับปรุงพันธุ์พืชยังคงต้องรวบยอดเอายีนที่ทนทานต่อการระบาดของแมลงและโรคที่ทนร้อนเข้าไว้ในจีโนมของพืชพันธุ์ใหม่ด้วย

 

 

 

จุดวิกฤติที่ท้าทายที่สุดคือผลกระทบของอุณหภูมิสูงต่อประสิทธิภาพการสังเคราะห์แสงของพืช เนื่องจากกลไกการสังเคราะห์แสงมีความอ่อนไหวต่ออุณหภูมิสูงเป็นอย่างมาก โดยเฉพาะในกลุ่มพืชที่เรียกว่า C3 ซึ่งมักจะเกิดกระบวนการยับยั้งด้วยแสง (photoinhibition) และการหายใจตอนกลางวันหรือการหายใจเชิงแสง (photorespiration) ได้ดีในสภาพอุณหภูมิสูงและแสงแดดจัด ซึ่งจะทำให้ผลผลิตของพืช C3 ถูกกระทบอย่างหนัก ในการปรับปรุงประสิทธิภาพการสังเคราะห์แสงนี้นักวิทยาศาสตร์อาจจำเป็นต้องใช้ความพยายามในการทำการดัดแปลง (re-engineer) กลไกการสังเคราะห์แสงแบบ C3 ทั้งหมด และเนื่องจากข้าวเป็นพืช C3 จึงน่าที่จะได้รับผลกระทบจากอุณหภูมิสูงอย่างแน่นอน นักวิทยาศาสตร์กำลังพยายามคิดค้นยีนที่ช่วยแก้ไขการเกิด photo-oxidation (หรือ photoinhibition) และเพื่อเพิ่ม CO2 compensation point ให้สูงขึ้น โดยการเพิ่มสมรรถนะของ antioxidation ที่เยื่อหุ้มไธลาคอยด์ (thylakoid membrane) พร้อมกับดัดแปลง (re-engineer) โปรตีน ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/ oxygenase (RubisCO) ให้มีความจำเพาะ (affinity) ต่อ CO2 ให้มากขึ้น นอกจากนี้ยังมีโครงการขนาดใหญ่อีกโครงการหนึ่ง คือการศึกษาวิวัฒนาการจากพืช C3 เป็น C4 หรือ C4 เป็น C3 ทั้งหมดนี้เพื่อว่าสักวันหนึ่งข้าวจะสามารถรักษาระดับการสังเคราะห์แสงได้ดีแม้ที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียสโดยไม่ต้องใช้น้ำมากมายอีกต่อไป

 

 

 

การปลดปล่อยก๊าซเรือนกระจก มีเทน (methane) จากนาข้าวเป็นเรื่องที่ทั่วโลกได้รับรู้และกำลังเป็นอุปสรรคที่สำคัญอันหนึ่งของการส่งออกข้าวของไทย พม่า และเวียดนามสู่ตลาดโลก เพราะอาจก่อให้เกิดข้อขัดขวางทางเทคนิค (technical barrier) ที่จะเป็นอุปสรรคในการส่งออกข้าวของไทย หากพิจารณาในมุมมองของสิ่งแวดล้อมในการปลูกข้าว การปล่อยให้น้ำท่วมขังนาเป็นระยะเวลานานเป็นสาเหตุที่ทำให้มีการสะสมและปลดปล่อยก๊าซเรือนกระจก มีเทน ออกมาจากดินผ่านต้นข้าว ปัจจุบันนักเกษตรได้หันมาสนใจการควบคุมการท่วมขังของดินนา โดยสลับกับการปล่อยน้ำให้นาแห้ง วิธีการดังกล่าวจะทำให้การปลดปล่อยก๊าซมีเทนน้อยลง ซึ่งสอดคล้องกับระบบการปลูกข้าวแบบ aerobic rice (SRI=System of Rice Intensification) แต่อย่างไรก็ตาม หากจัดการปุ๋ย N ไม่ดีพอก็จะทำให้เกิดการปลดปล่อย nitrous oxide ซึ่งเป็นก๊าซเรือนกระจกที่สำคัญเพิ่มขึ้นแทน ดังนั้นการค้นหาความสมดุลจึงเป็นประเด็นที่ต้องการคำตอบและการปรับปรุงพันธุ์ข้าวให้ปรับตัวเข้ากับสภาพการใช้น้ำน้อยแบบ aerobic rice ก็จะเป็นกุญแจสำคัญของการแก้ไขปัญหาเหล่านี้

 

 

 

ประเทศไทย เวียดนาม พม่า กัมพูชา และลาว คืออู่ข้าวของโลก ไทยและเวียดนามส่งออกข้าวเลี้ยงประชากรโลกปีละกว่า 15 ล้านตัน พม่าซึ่งเคยเป็นผู้ส่งออกข้าวอันดับหนึ่งของโลกก่อนไทยจะชิงตำแหน่งนี้ไป ก็เริ่มกลับฟื้นตัวผลิตข้าวได้มากขึ้นจนใกล้ส่งออกข้าวได้แล้วรวมทั้งกัมพูชาด้วย สภาวะโลกร้อนในเขตลุ่มแม่น้ำโขงตอนล่างนี้ได้เริ่มเกิดขึ้นอย่างรุนแรง เช่น มหาอุทกภัยที่เกิดขึ้นในพม่า ไทย กัมพูชา ลาว และเวียดนาม ย่อมเป็นที่ประจักษ์แล้วว่า ได้ส่งผลกระทบต่อการผลิตอาหารของโลกอย่างชัดเจน ดังนั้นเราจึงควรที่จะเริ่มวางแผนพัฒนาพันธุ์ข้าวให้ทนทานและเป็นมิตรกับสิ่งแวดล้อมเพื่อลดอัตราเสี่ยงจากการเปลี่ยนแปลงของสภาพภูมิอากาศโลกในอู่ข้าวของโลกให้ได้

 

 

 

ระบบการสังเคราะห์แสงของพืชบนโลกนี้สามารถแบ่งออกได้เป็นสามกลุ่มหลัก ๆ คือ ระบบการสังเคราะห์แสงแบบ C3 แบบ C4 และแบบ CAM ซึ่งพืชที่ใช้ระบบการสังเคราะห์แสงแต่ละแบบจะถูกเรียกว่า พืช C3 พืช C4 และพืช CAM ตามลำดับ ประชากรพืชส่วนใหญ่ของโลกจะเป็นพืช C3 รวมทั้งพืชที่ใช้เป็นพืชอาหารหลักเช่นข้าว ข้าวสาลี มันฝรั่ง ถั่วต่าง ๆ แต่ก็ยังมีพืชอาหารหลักบางชนิดเป็นพืช C4 เช่นข้าวโพด ข้าวฟ่าง อ้อย โดยทั่วไปพืช C4 จะให้ผลผลิตเฉลี่ยและมีประสิทธิภาพของการใช้น้ำและธาตุอาหาร (N) ได้ดีกว่าพืช C3 ดังนั้นจึงได้มีการเสนอแนะว่า ควรที่จะมีการปรับปรุงพันธุ์พืชเพื่อผสมผสานกลไกของพืช C4 บางส่วนเข้าไปยังพืช C3 เพื่อที่จะทำให้พืช C3 สามารถสร้างผลผลิตได้สูงขึ้น วิธีการนี้จะประสบความสำเร็จได้นั้นจะต้องทราบถึงพันธุกรรมที่ควบคุมวัฏจักร C4 (C4 pathway) เป็นอย่างดี ซึ่งหมายความว่านักวิจัยจะต้องมุ่งเน้นในการวิจัยที่เข้าใจถึงการแสดงออกของยีนที่ควบคุมอยู่ในวัฏจักร C4 จึงจะทำให้สามารถเข้าใจถึงกระบวนการสังเคราะห์แสงแบบ C4 ได้อย่างลึกซึ้งยิ่งขึ้น

 

 

ประสิทธิภาพการสังเคราะห์แสงภายใต้โลกร้อน

2.1 จุดอ่อนของระบบการสังเคราะห์แสงแบบ C3 ภายใต้สภาวะโลกร้อนเปรียบเทียบกับพืชแบบ C4 และ CAM
กระบวนการสังเคราะห์แสง

กระบวนการสังเคราะห์แสง (photosynthesis) เป็นกระบวนการเริ่มต้นของกระบวนการผลิตของสิ่งมีชีวิต โดยสิ่งมีชีวิตที่มีความสามารถในการสังเคราะห์แสงจะสามารถนำพลังงานแสงมาตรึงคาร์บอนไดออกไซด์ (CO2) และสร้างเป็นอาหารเก็บไว้ในรูปสารอินทรีย์ ซึ่งจะถูกใช้เป็นแหล่งพลังงานในการดำรงชีวิตของสิ่งมีชีวิตทั้งหลายบนโลก พืชและสิ่งมีชีวิตที่มีความสามารถในการสังเคราะห์แสงได้มีทั้งที่เป็นโปรแคริโอท (prokaryote) และยูแคริโอท (eukaryote) กลุ่มที่เป็นโปรแคริโอท ได้แก่ แบคทีเรียที่สังเคราะห์ด้วยแสงได้ (photosynthetic bacteria) และ cyanobacteria ส่วนพวกยูแคริโอทที่สังเคราะห์ด้วยแสงได้ ได้แก่ สาหร่ายชนิดต่าง ๆ มอส เฟิร์น สน ปรง และพืชมีดอก พืชและสิ่งมีชีวิตที่มีกระบวนการสังเคราะห์แสงจะต้องมีสารที่มีความสามารถในการดูดกลืนพลังงานแสง แล้วนำพลังงานนั้นไปใช้ในการสร้างพันธะเคมี (chemical bond)

 

 

 

องค์ประกอบสำคัญในกระบวนการสังเคราะห์แสง

Photosynthetic pigments

นโมเลกุลของสารอินทรีย์ โมเลกุลที่มีความสามารถในการดูดกลืนแสงที่มีอยู่ในพืชและสิ่งมีชีวิตเหล่านี้คือรงควัตถุ (pigments) รงควัตถุที่ใช้ในการสังเคราะห์แสง (photosynthetic pigments) สามารถแบ่งออกได้เป็นสามประเภท คือ คลอโรฟิลล์ (chlorophyll) ไฟโคบิลลิน (phycobillins) และแคโรทีนอยด์ (carotenoids) ซึ่งรงควัตถุแต่ละประเภทมีความสามารถในการดูดกลืนพลังงานแสงได้ในช่วงคลื่นต่างกัน รงควัตถุประเภทคลอโรฟิลล์ สามารถพบทั่วไปในพืชและสิ่งมีชีวิตที่มีกระบวนการสังเคราะห์แสง รงควัตถุประเภทไฟโคบิลลินเป็นรงควัตถุชนิดที่เรียกว่าเป็นตัวช่วยในการดูดกลืนแสง ( accessory light-harvesting pigments) ซึ่งพบได้ใน cyanobacteria และสาหร่ายสีแดง รงควัตถุประเภทแคโรทีนอยด์ ซึ่งจัดว่าเป็นตัวช่วยในการดูดกลืนแสงด้วยเช่นกัน เป็นกลุ่มรงควัตถุสีเหลือง-ส้มที่พบได้ทั่วไปในพืชและสิ่งมีชีวิตที่สามารถสังเคราะห์แสงได้ มีหน้าที่ในการช่วยรับพลังงานแสงและทำหน้าที่ในการปกป้องอันตรายจากแสง (photoprotective agents) ในสิ่งมีชีวิตที่เป็นโปรแคริโอท รงควัตถุเหล่านี้จะฝังตัวอยู่บนเยื่อเมมเบรน (photosynthetic membrane) ในขณะที่พืชและสิ่งมีชีวิตกลุ่มยูแคริโอท จะมีออร์แกเนล (organelle) ที่ทำหน้าที่ในกระบวนการสังเคราะห์แสงโดยเฉพาะคือ คลอโรพลาสต์ (chloroplast)

 

ภาพที่ 1 โครงสร้างและกิจกรรมการสังเคราะห์แสงที่เกิดขึ้นภายในคลอโรพลาสต์

 

Chloroplast

คลอโรพลาสต์ส่วนใหญ่ของพืชจะมีรูปร่างกลมรีและมีเยื่อหุ้มสองชั้น คือ เยื่อหุ้มชั้นนอก (outer membrane) และเยื่อหุ้มชั้นใน (inner membrane) ภายในบรรจุของเหลวเรียกว่า สโตรมา (stroma) ซึ่งมีเอนไซม์ที่จำเป็นสำหรับกระบวนการตรึงคาร์บอนไดออกไซด์ในกระบวนการสังเคราะห์แสง ด้านในของคลอโรพลาสต์จะมีไธลาคอยด์ (thylakoid) ซึ่งบางส่วนของไธลาคอยด์จะซ้อนทับกันเป็นชั้น ๆ เรียกชั้นของไธลาคอยด์นี้ว่ากรานุม (granum) หรือกรานุม ลาเมนลา (granum lamellae) และยังมีส่วนที่ไม่ได้ซ้อนทับเรียกว่าสโตรมา ลาเมลลา (stroma lamellae) ซึ่งจะมีลักษณะเป็นท่อเชื่อมติดต่อระหว่างกรานุม ในส่วนของเยื่อหุ้มชั้นในหรือเยื่อหุ้มไธลาคอยด์ (thylakoid membrane) เป็นบริเวณที่มีรงควัตถุที่ใช้ในกระบวนการสังเคราะห์แสงแทรกตัวอยู่ ไธลาคอยด์เป็นโครงสร้างที่ใช้รับพลังงานจากแสงเพื่อใช้ในการสังเคราะห์แสง สร้างขึ้นจากส่วนหนึ่งของเยื่อหุ้มชั้นในของคลอโรพลาสต์ (inner membrane) บริเวณกรานุมซึ่งมีการซ้อนทับกันจะมีลักษณะเป็นถุงกลมแบนวางซ้อนกันเป็นชั้น ๆ ภายในถุงมีของเหลวบรรจุอยู่ เรียกส่วนภายในถุงนี้ว่าลูเมน (lumen) หรือ thylakoid space

 

 

ปฏิกิริยาเคมีของกระบวนการสังเคราะห์แสง

ในการเปลี่ยนพลังงานแสงให้เป็นพลังงานเคมีในโมเลกุลของสารอินทรีย์นั้นแบ่งออกเป็นสองขั้นตอนคือ ขั้นตอนแรกเป็นปฏิกิริยาที่ต้องใช้แสง (light reaction) และขั้นตอนที่สองเป็นปฏิกิริยาตรึงคาร์บอนไดออกไซด์ (CO2 fixation reaction) หรือที่เคยเรียกกันว่า dark reaction

 

ประเภทของระบบการสังเคราะห์แสง

1) ระบบการสังเคราะห์แสงแบบ C3: ระบบการสังเคราะห์แสงที่เริ่มต้นด้วยการที่ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ (CO₂) รวมตัวกับสารตั้งต้น ribulose-1,5-bisphosphate (RubP) โดยอาศัยเอนไซม์ ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RubisCO) ในวัฏจักรคัลวินแล้วได้ผลิตภัณฑ์ที่เป็นสารอินทรีย์ที่มีองค์ประกอบของคาร์บอน 3 อะตอมคือ 3-phosphoglycerate (3-PGA) เป็นผลิตภัณท์แรกและเกิดการเปลี่ยนแปลงต่อไปจนได้ผลิตภัณฑ์ในรูปของน้ำตาลชนิดต่าง ๆ เรียกว่าการสังเคราะห์แสงแบบ C3 และเรียกวัฏจักรแบบนี้ว่าวัฏจักร C3 (C3 photosynthetic pathway) (ภาพที่ 4a) พืชที่ใช้ระบบการสังเคราะห์แสงแบบนี้จึงถูกเรียกว่าพืช C3 พืชกลุ่มนี้ถือเป็นประชากรส่วนใหญ่ของพืชที่พบบนโลกนี้คิดเป็นจำนวน 95 เปอร์เซนต์ พืช C3 ที่สำคัญได้แก่ ข้าวเจ้า ข้าวสาลี ข้าวบาเลย์ และถั่วต่าง ๆ การสังเคราะห์แสงในใบของพืช C3 จะเกิดขึ้นในเซลล์ที่มีชื่อว่า เมโซฟิลล์ (mesophyll cells; M) โดยจะมีอยู่สองชนิดแบ่งตามความแตกต่างของโครงสร้างคือ palisade mesophyll และ spongy mesophyll พืช C3 อาจมีกลุ่มเซลล์ล้อมรอบกลุ่มท่อลำเลียงที่เรียกว่า บันเดิลชีท (bundlesheath cells; BS) หรือไม่ก็ได้

 

 

ภาพที่ 4 กระบวนการสังเคราะห์แสงในพืชกลุ่ม C3 (A) และกระบวนการสังเคราะห์แสงในพืชกลุ่ม C4 ชนิด NADP-ME (B) คำย่อ: TP, triosephosphate.
ที่มา: Mitsue Miyao, 2002

 

 

 

2) ระบบการสังเคราะห์แสงแบบ C4: ระบบการสังเคราะห์แสงแบบ C4 เป็นระบบการสังเคราะห์แสงที่มีการตรึง CO₂ สองครั้ง ครั้งแรก CO₂ จากอากาศซึ่งผ่านเข้ามาทางปากใบ (stomata) จะถูกตรึงไว้โดยการรวมกับสาร phosphoenolpyruvate (PEP) โดยอาศัยเอนไซม์ phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) เกิดเป็นสารประกอบที่มีคาร์บอน 4 อะตอมคือ oxaloacetate (OAA) ซึ่งจะถูกเปลี่ยนแปลงต่อไปเป็น malate (MA) จากนั้น CO₂ จะถูกปลดปล่อยออกมาจากโมเลกุลของ MA และจะถูกตรึงอีกครั้งหนึ่งโดยการรวมตัวกับ RubP แล้วเข้าสู่วัฏจักรคัลวินต่อไปเช่นเดียวกับระบบการสังเคราะห์แสงแบบ C3 (ภาพที่ 4b) พืชที่ใช้ระบบการสังเคราะห์แสงแบบ C4 นี้ เรียกว่า พืช C4 ซึ่งมักเป็นพืชที่มีถิ่นกำเนิดในเขตศูนย์สูตร เช่น ข้าวโพด อ้อย ข้าวฟ่าง พืชกลุ่มนี้มีโครงสร้างภายในของใบ (Kranz Anatomy)ที่เด่นชัดคือ จะมีเซลล์ bundle sheath (BS) ที่มีคลอโรพลาสต์ล้อมรอบกลุ่มท่อลำเลียงหรือที่เรียกว่าเส้นใบ (veins) ถัดออกมาจากเซลล์ BS จะเป็นเซลล์ mesophyll (M) (ภาพที่ 5a ดูที่ด้านล่าง)วัฏจักรคัลวินของพืช C4 เกิดขึ้นในเซลล์ BS แต่ CO₂ ที่จะป้อนเข้าสู่วัฏจักรคัลวินนั้นได้รับมาจากกระบวนการเปลี่ยนแปลงโมเลกุลของสารอินทรีย์ในเซลล์ M (ภาพที่ 4b, 5b) ความเข้มข้นของ CO₂ ที่ถูกปลดปล่อยในบริเวณ BS มีความเข้มข้นสูงมากเมื่อเทียบกับความเข้มข้นของ O₂ ที่มีอยู่ภายในเซลล์ ทำให้ปฏิกิริยาการตรึง O₂ โดย RubP เกิดได้น้อย พืช C4 จึงมีการสูญเสียคาร์บอนอะตอมจากกระบวนการหายใจเชิงแสง (photorespiration) น้อยมากจนวัดไม่ได้ในสภาพปกติ

 

 

 

3) ระบบการสังเคราะห์แสงแบบ CAM (Crassulacean acid metabolism): ระบบการสังเคราะห์แสงแบบ Crassulacean acid metabolism (CAM) นี้คล้ายคลึงกับระบบ C4 แต่แตกต่างกันที่ช่วงเวลาของการตรึง CO₂ เกิดขึ้นในเวลากลางคืน ส่วนการสังเคราะห์แสงโดยระบบ C4 เกิดขึ้นในเวลากลางวัน และการสังเคราะห์แสงแบบ CAM ทั้งหมดเกิดขึ้นในเซลล์ mesophyll (M) พืชที่มีการสังเคราะห์แสงแบบนี้เรียกพืช CAM ได้แก่ พืชอวบน้ำ กระบองเพชร และ stonecrops เช่น สับปะรด กล้วยไม้ มอส และเฟิร์นบางชนิด เป็นต้น

 

ภาพที่ 6 ภาพรวมของขบวนการตรึงคาร์บอนและเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องภายใต้แสงและไร้แสงของระบบพืชสะสมแป้งชนิด CAM

 

 

เช่น M. crystallinum เส้นประแสดงสาร intermediate และเอนไซม์ที่อยู่ระหว่าง metabolites: G3P, glycerate‐3‐phosphate; Glc, glucose; Glc‐1‐P, glucose‐1‐phosphate; Glc‐HXK, glucose hexokinase; NADP‐ME, NADP‐dependent malic enzyme; OAA, oxaloacetic acid; PEP, phosphoenolpyruvate; PEPC kinase, phosphoenolpyruvate carboxylase kinase; PEPC‐P, PEPC in phosphorylated state; PGM, phosphoglucose mutase; STP, starch phosphorylase; TPT, triose‐phosphate translocator; V‐ATPase, vacuolar H+‐ATPase.

 

 

 

สภาวะการเปลี่ยนแปลงของภูมิอากาศ

การสังเคราะห์แสงแบบ C3 และ C4 มีความเกี่ยวพันกับสภาวะการเปลี่ยนแปลงของภูมิอากาศ ระบบการสังเคราะห์แสงทั้งสองแบบนี้ตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงของปริมาณ CO2 ในชั้นบรรยากาศได้แตกต่างกัน การสังเคราะห์แสงแบบ C4 ได้รับประโยชน์มากกว่าภายใต้สภาวะที่มี CO2 ในชั้นบรรยากาศน้อย และ/หรือเมื่ออุณหภูมิสูง ในขณะที่ในพืช C3 จะเกิดกระบวนการหายใจเชิงแสง (photorespiration) ค่อนข้างสูงในสภาพบรรยากาศดังกล่าว ภายใต้สภาวะเช่นนี้ประสิทธิภาพการสังเคราะห์แสงแบบ C4 จะเหนือกว่าแบบ C3 แต่อย่างไรก็ตาม ภายใต้สิ่งแวดล้อมที่มีการยกระดับของปริมาณ CO2 หรือที่อุณหภูมิต่ำ ประสิทธิภาพของการสังเคราะห์แสงใน C3 จะสูงกว่า เพราะว่าการหายใจเชิงแสงจะลดลงและการใช้ ATP ที่สิ้นเปลืองของ C4 ทำให้มันด้อยประสิทธิภาพลง ในสภาวะที่มีแสงแดดจัด ร้อน และแห้งแล้ง พืช C3 จะลดการสูญเสียน้ำด้วยการปิดปากใบส่วนใหญ่เอาไว้ ทำให้ CO2 จากอากาศผ่านเข้ามาทางปากใบได้น้อยมาก รวมทั้ง O2 ที่เกิดจากปฏิกิริยาที่ต้องใช้แสงไม่สามารถปล่อยออกสู่บรรยากาศได้จะถูกสะสมอยู่ในคลอโรพลาสต์มากขึ้นเรื่อย ๆ เมื่อการตรึง CO2 เกิดขึ้นได้น้อย พืช C3 จะทำการตรึง O2 ที่สะสมคั่งค้างอยู่นั้นเอาไว้แทนเนื่องจากเอนไซม์ RubisCO นั้นมีความสามารถในการจับกับออกซิเจนได้ด้วย เมื่อ O2 รวมตัวกับ RubP เกิดเป็นสารประกอบอินทรีย์ที่มีคาร์บอน 2 อะตอมคือ phosphoglycolate (2-PG) สารอินทรีย์ที่เกิดขึ้นนี้จะถูกขนส่งออกจากคลอโรพลาสต์ และถูกนำไปสลายที่ไมโตคอนเดรียและเพอร์ออกซิโซม (peroxisome) ซึ่งจะทำให้ได้ CO2 ออกมา และจะสามารถถูกนำไปใช้ในการสร้างน้ำตาลต่อไปได้ แต่อย่างไรก็ตามการสร้างอาหารจะเกิดขึ้นน้อยลงกว่าปกติ ปฏิกิริยาการใช้ O2 และปลดปล่อย CO2 ในขณะที่มีแสงนี้เรียกว่าการหายใจเชิงแสง (photorespiration) เมื่อพืชมีการหายใจเชิงแสงเกิดขึ้นจะทำให้เกิดการสูญเสียสารอินทรีย์ในวัฏจักรคัลวิน (Calvin cycle) บางส่วนไปเนื่องจากได้ถูกนำไปใช้ในการตรึง O2 จึงมีผลทำให้ประสิทธิภาพในการสังเคราะห์แสงลดลง

 

 

 

 

2.2 Photoinhibition: การยับยั้งการสังเคราะห์แสง

อุณหภูมิสูงมีผลกระทบต่อการเจริญเติบโตและการให้ผลผลิตของพืช โดยเฉพาะขบวนการสังเคราะห์แสง จัดว่ามีความไวต่อความร้อนสูงสุด แม้เพียงอุณหภูมิที่สูงกว่าอุณหภูมิพอเหมาะ(optimum temperature) เพียงเล็กน้อยก็ตาม ก็ทำให้เกิด photoinhibition สมมุติฐานหนึ่งที่อธิบายถึงสภาวะกดดันจากอุณหภูมิสูงมีผลต่อ photoinhibition ก็คือความร้อนมีผลต่อRuBP carboxylation rate โดย activase ลดระดับการทำงานลงจนไม่สามารถกระตุ้นให้ RuBP เริ่มทำงาน( Salvucci and Crafts-Brandner 2004) อีกสมมุติฐาน เสนอว่าอุณหภูมิไปยับยั้งการส่งผ่านอิเล็คตรอน(electron transport) และลดทอน Rubisco activation state ภายใต้ความกดดันจากความร้อน สมมุติฐานที่สามกล่าวว่าความเครียดจากความร้อนไม่ได้ยับยั้งการทำงานของPSIIโดยตรง แต่มีผลต่อการซ่อมแซมPSIIมากกว่า

ในสภาพแปลงในเวลากลางวันเมื่ออุณหภูมิสูงขึ้นอย่างรวดเร็วจนอาจถึง40°C พร้อมกับความเข้มของแสงก็จะสูงขึ้นตามไปด้วย(ระดับ 1000-2000 μmol m-2s-1) ยิ่งทำให้ photoinhibition เกิดขึ้นได้ง่าย อาจกล่าวได้ว่า ความร้อนกับความเข้มของแสงมีผลกระทบที่เสริมทำให้เกิด photoinhibition ได้ง่าย

ผลของอุณหภูมิสูง ไม่มีผลต่อ Fv/Fm แต่มีผลต่ออัตราของ CO2 assimilation (อัตราการตรึง CO2) และPSII photo chemistry เพื่อปกป้องไม่ให้เกิดความเสียหาย ascorbateได้ถูกผลิตขึ้นในchloroplast

การที่พืชได้รับแสงความเข้มจัดเป็นระยะเวลานาน ๆ จะทำให้เกิดความเสียหายอันเนื่องมาจากแสง (photodestruction) ต่อรงควัตถุที่ใช้ในการสังเคราะห์แสง และเนื่องจากการเกิดการซีดจาง (discoloration หรือ bleaching) ของรงควัตถุขึ้นอยู่กับออกซิเจนและแสง ปรากฏการณ์นี้จึงถูกเรียกว่า “photooxidation” ด้วย และอาจเป็นสาเหตุของการตายของเซลล์หรือสิ่งมีชีวิต (Powles, 1984; Hendrey et al., 1987) การวัด OX อาจทำได้โดยดู lipid oxidation ผ่าน peroxidase(LPO) โดยองค์ประกอบที่ช่วยให้เกิดความต้านทานต่อ photooxidation คือ chlorophyll a/b ratio, lecithin และ Xanthophyll cycle

 

 

 

2.3 Photorespiration การหายใจในเวลากลางวันหรือการหายใจเชิงแสง

2.3.1. กลไกการเกิดการหายใจเชิงแสง (photorespiration)

กระบวนการสังเคราะห์แสงของพืชโดยใช้คาร์บอน ประกอบด้วยสองกระบวนการที่เชื่อมต่อกัน ได้แก่ วัฏจักรของ C3 หรือวัฏจักรคัลวิน ( the reductive photosynthetic corbon metabolism) และวัฏจักรแบบ C2 (oxidative photosynthesis carbon metabolism) หรือวัฏจักรการหายใจเชิงแสง (photorespiration) ทั้งสองกระบวนการเริ่มด้วยการทำงานของเอนไซม์ชนิดเดียวกันคือ RubisCO โดยมี RubP เป็นสารตั้งต้น โดยการเกิด carboxylation (ตรึง CO₂) ของ RubP จะทำให้ได้ 3-phosphoglycerate (3-PGA) ในขณะที่การเกิด oxygenation (ตรึง O₂) จะสังเคราะห์ได้หนึ่งโมเลกุลเป็น 3-PGA และอีกหนึ่งโมเลกุลเป็น 2-phosphoglycolate (2-PG) ซึ่งอัตราส่วน 3-PGA/2-PG นั้นได้ถูกกำหนดโดยอัตราส่วนของ CO₂/O₂ ในคลอโรพลาสต์ และอัตราส่วนของ CO₂/O₂ จะเป็นปัจจัยกำหนดความจำเพาะของปฏิกิริยา ให้กับ RubisCO ว่าจะเอื้อให้เกิดปฏิกิริยาแบบ carboxylation หรือ oxygenation ซึ่งจะมีความผันแปรระหว่างชนิดของพืช การคำนวณหาปัจจัยจำเพาะสำหรับ rubisCO (Rubisco specificity factor) สามารถคำนวณได้จาก สูตร ( = Vc/Vo = Vc/Kc x Ko/Vo x [CO2]/[O2]; โดย Kc และ Ko เป็นค่าคงที่ของ Michaelis Menten สำหรับ CO₂ และ O₂ ส่วน Vc และ Vo นั้นเป็นค่า maximal velocities สำหรับ carboxylation และ oxygenation) กระบวนการของ photorespiration (C2 cycle) ทำหน้าที่เป็นระบบการหมุนเวียนของคาร์บอน (carbon recovery system) ซึ่งจะเปลี่ยน 2-PG ไปเป็น 3-PGA ที่จะสามารถเข้าสู่วงจรการสังเคราะห์แสงแบบ reductive (C3 cycle)ได้ กระบวนการดังกล่าวจะทำงานร่วมกันระหว่าง 4 ภาคส่วน (compartments) ภายในเซลล์ ได้แก่ chloroplast, peroxisome, mitochondria และ cytosol และต้องอาศัยเอนไซม์ที่ต้องทำงานร่วมกันจำนวนมากรวมทั้งกระบวนการเคลื่อนย้ายสารด้วย (ภาพที่ 7)

 

 

ภาพที่ 7

 

 

กระบวนการตรึง O₂ และ CO₂ ในคลอโรพลาสต์จะเกิดขึ้นในสภาพสารละลาย ทั้ง O₂ และ CO₂ ในอากาศจะต้องละลายน้ำก่อนจึงแพร่เข้าสู่คลอโรพลาสต์และทำปฏิกิริยากับ RubP เนื่องจากปฏิกิริยาการตรึง O₂ หรือ CO₂ เกิดขึ้นที่บริเวณ active site เดียวกัน ดังนั้น O₂ จะแข่งขันกับ CO₂ ในการทำปฏิกิริยากับ RuBP ในสภาพที่ความเข้มข้นของ O₂ เท่ากับ CO₂ นักวิทยาศาสตร์พบว่า ในสภาพหลอดทดลอง เอนไซม์ rubisCO ของพืชชั้นสูงตรึง CO₂ ได้เร็วกว่าตรึง O₂ ถึง 80 เท่า แต่เนื่องจากสารละลายที่อยู่สภาพสมดุลกับอากาศปกติที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส จะมี O₂ มากกว่า CO₂ ถึง 24 เท่า ดังนั้น อัตราการตรึง CO₂ ในใบพืชจึงมากกว่าอัตราการตรึง O₂ เพียงประมาณ 3-4 เท่า ดังนั้นในสภาพบรรยากาศปัจจุบัน (ซึ่งมีปริมาณของ O₂ สูง) กระบวนการ oxygenation ของ rubisCO จึงเกิดขึ้นได้อย่างรวดเร็วในพืช C3 ภายใต้สภาพแวดล้อมต่าง ๆ ซึ่งทำให้เกิดการหายใจเชิงแสง (photorespiration) ขึ้น วัฏจักร C2 ของ photorespiration ถือว่าเป็นการสิ้นเปลืองพลังงานไปโดยเปล่าประโยชน์ ดังนั้นนักวิจัยจึงได้มีความพยายามอย่างมากในช่วงเวลา 30 ปีที่ผ่านมาในการที่จะลดความสูญเสียดังกล่าว เช่น การพยายามดัดแปลงปัจจัยจำเพาะของ RubisCO (เพื่อให้จำเพาะต่อ CO₂ มากขึ้น) หรือผ่านทางการดัดแปลง metabolism ของกระบวนการเกิดการหายใจเชิงแสง (photorespiration) เพื่อลด/ยับยั้งหรือปรับเปลี่ยนกระบวนการนี้ ดังมีรายงานว่ามีการค้นพบเส้นทางอ้อม (synthetic detour) ของกระบวนการหายใจเชิงแสง (photorespiration) เช่นที่พบใน cyanobacteria ซึ่งมีวิวัฒนาการมาก่อนพืชที่มีคลอโรพลาสต์ ทำให้ทราบถึงกระบวนการหายใจทางแสงแบบทุติยภูมิ และได้นำไปทดลองใน Arabidopsis เพื่อข้ามผ่านกระบวนการหายใจเชิงแสง ผลของกระบวนการแบบทุติยภูมินี้ทำให้เกิดปริมาณของ CO₂ สูงในคลอโรพลาสต์ จะส่งผลทางบวกต่อการเจริญเติบโตของพืช

 

 

 

2.3.2. วัฏจักรการหายใจเชิงแสง (Photorespiration pathway)

พืชใช้วัฎจักรของกระบวนการหายใจเชิงแสงเพื่อนำคาร์บอนในสารประกอบที่ ถูกออกซิไดซ์กลับมาใช้ประโยชน์ได้ใหม่ โดยสามารถเปลี่ยนกลับมาเป็นสาร 3-PGA โดย 3-PGA หนึ่งโมเลกุลจะกลับคืนมาจาก 2-PG จำนวน 2 โมเลกุล แต่ต้องสูญเสียสารประกอบคาร์บอนในรูปของ CO₂ ไปหนึ่งโมเลกุล ดังนั้นจึงนำคาร์บอนกลับคืนมาได้ 75% (3 อะตอม จาก 4 อะตอมคาร์บอน) ทั้งนี้วัฎจักรของกระบวนการการหายใจเชิงแสงจำเป็นต้องมีวัฎจักรคัลวินดำเนิน อยู่ด้วยเพื่อนำ 3-PGA ไปใช้สร้าง RubP ต่อไปได้

วัฎจักรของกระบวนการหายใจเชิงแสง (ภาพที่ 7) เริ่มจากเอนไซม์ rubisCO เร่งปฏิกิริยาการตรึง O₂ ด้วยโมเลกุล RubP เพื่อสร้าง 2-PG จากนั้นเกิดปฏิกิริยาไฮโดรไลซิส (hydrolysis) เพื่อเปลี่ยนเป็น glycolate ในคลอโรพลาสต์ แล้ว glycolate จะถูกออกซิไดซ์เป็น glyoxylate และ hydrogen peroxide (H₂O₂) ในเพอร์ออกซิโซม (peroxisome) ในขณะที่ H₂O₂ จะถูกสลายโดยการทำงานของเอนไซม์ catalase สาร glycolate จะรับหมู่อะมิโน (amino) โดยกระบวนการเคลื่อนย้ายหมู่อะมีน (transamination) เพื่อเปลี่ยนเป็นกรดอะมิโน glycine ก่อนจะออกจากเพอร์ออกซิโซม และเข้าสู่ไมโตคอนเดรีย ซึ่ง glycine สองโมเลกุล จะเปลี่ยนเป็นกรดอะมิโน serine และ CO₂ (เป็นปฏิกิริยาที่เซลล์สูญเสียธาตุคาร์บอน) จากนั้น serine จะกลับไปสู่เพอร์ออกซิโซม เพื่อเปลี่ยนเป็น glycerate ด้วยปฏิกิริยาการเคลื่อนย้ายหมู่อะมีน ตามด้วยปฏิกิริยารีดักชัน และในที่สุด glycerate จะเคลื่อนย้ายเข้าสู่คลอโรพลาสต์และเข้าสู่ปฏิกิริยา phosphorylation เปลี่ยนเป็น 3-PGA ซึ่งเป็นสารประกอบในวัฎจักรคัลวินต่อไป

 

 

 

2.3.3. บทบาทของการหายใจเชิงแสง (photorespiration)

นัก วิทยาศาสตร์เชื่อว่ากระบวนการหายใจเชิงแสง (photorespiration) อาจทำหน้าที่สำคัญในการป้องกันความเสียหายต่อส่วนประกอบของการสังเคราะห์แสง (photosynthetic apparatus) โดยเฉพาะในสภาพที่ใบพืชได้รับแสงมาก แต่มีปริมาณ CO₂ เพื่อการสังเคราะห์แสงต่ำ เช่นในกรณีที่ปากใบปิดเพราะพืชขาดน้ำ ทำให้พืชมี CO₂ ที่ใช้ในการตรึงน้อยในขณะที่ได้รับแสงมาก การหายใจเชิงแสงจึงเป็นการช่วยให้ ATP และ NADPH ที่อาจสร้างขึ้นมากเกินความต้องการ (จากระบบ photosystem II) ถูกนำไปใช้ได้ (ในกระบวนการหายใจเชิงแสง) จึงสามารถป้องกันความเสียหายที่อาจเกิดขึ้นจากกระบวนการ photoinhibition การศึกษาใน Arabidopsis กลายพันธุ์ที่ไม่มีการหายใจเชิงแสง เนื่องจากขาดเอนไซม์ที่สำคัญบางชนิด พบว่าพืชสามารถเจริญเติบโตได้ดีในสภาพที่มี CO₂ ในระดับสูง (2% CO₂) แต่จะตายอย่างรวดเร็วเมื่อย้ายออกสู่สภาพอากาศปกติ (ซึ่งมี CO₂ เพียง 0.035%) นอกจากนี้ การหายใจเชิงแสงยังมีความสำคัญต่อการตรึงไนโตรเจนในรูปไนเตรทซึ่งเป็น อนินทรีย์สารเพื่อใช้ประโยชน์ในการเจริญเติบโต ดังที่ Arnold (2004) จาก University of California Davis แสดงให้เห็นว่า เมื่อปลูกข้าวสาลีและ Arabidopsis ในสภาพบรรยากาศที่มีปริมาณ CO₂ มากกว่าปกติหรือในสภาพบรรยากาศที่มีปริมาณ O₂ น้อยกว่าปกติ ซึ่งในทั้งสองสภาพนี้ทำให้พืชมีระดับของการหายใจเชิงแสงน้อยลงแล้ว กระบวนการตรึงไนโตรเจนในรูปไนเตรทของพืชทั้งสองชนิดจะลดน้อยลงด้วย และในที่สุดจะทำให้เกิดอาการขาดธาตุไนโตรเจนและเป็นสาเหตุทำให้การเจริญเติบ โตของพืชลดลง

 

 

 

2.3.4. การหายใจเชิงแสงจำเป็นต่อสิ่งมีชีวิตที่สังเคราะห์แสงได้ทุกชนิด

เนื่องจากการทำงานของ RubisCO สามารถเกิดได้ทั้ง 2 แบบ (dual functions) คือเร่งปฏิกิริยา carboxylation และ oxygenation ดังนั้นในสภาวะที่มีออกซิเจน 2-phosphoglycolate (2-PG) อาจถูกสร้างขึ้นได้ทุกเมื่อ สิ่งมีชีวิตที่สังเคราะห์แสงได้จึงต้องการกระบวนการสำหรับเปลี่ยน 2-PG จึงกล่าวได้ว่าการหายใจเชิงแสง (photorespiration) มีความจำเป็นและอาจเป็นเหตุผลที่ว่าทำไมยีนที่ถอดรหัสเอนไซม์ที่เกี่ยวข้อง กับการเกิดการหายใจเชิงแสงจึงถูกพบในพืชที่มีสีเขียวโดยทั่วไป แต่ก็ได้มีสมมติฐานว่าสำหรับพืชชั้นสูงหรือสิ่งมีชีวิตที่สังเคราะห์แสงได้ บางชนิด ซึ่งมีการพัฒนากลไกสำหรับเพิ่มความเข้มข้นของ CO₂ รอบ ๆ RubisCO ทำให้สามารถยับยั้งการสร้าง 2-PG ได้ อาจไม่ต้องการกระบวนการหายใจเชิงแสง (photorespiration) อย่างสมบูรณ์แบบก็ได้ อย่างไรก็ตามได้มีผลการวิจัยสองชิ้นที่รายงานผลการศึกษาหักล้างสมมุติฐานดัง กล่าว ผลการวิจัยแรกได้แก่รายงานของ Zelitch และคณะ (2008) ซึ่งได้ทดลองแยกข้าวโพดกลายพันธุ์ที่ได้มาโดยวิธีสอดแทรกทรานสโพซอน (transposon integration) ของยีน GO1 ซึ่งถอดรหัสสำหรับเอนไซม์ glycolate oxidase ที่ทำหน้าที่เปลี่ยน glycolate เป็น glyoxylate ในเพอร์ออกซิโซม โดยทางทฤษฎีแล้วข้าวโพดนั้นเป็นพืช C4 ซึ่งจะเกิดการหายใจเชิงแสงได้น้อยเพราะมีกลไกการปั๊ม CO₂ ไปยังบริเวณใกล้เคียง RubisCO (ด้วยวัฏจักร C4) ดังนั้นจึงไม่น่าจะได้รับผลกระทบเมื่อเกิดความเสียหายกับระบบการหายใจเชิง แสง แต่จากผลการทดลองพบว่า ข้าวโพดพันธุ์กลายแบบ homozygous ของยีน GO1 ไม่สามารถดำรงชีวิตอยู่ได้ในสภาพอากาศปกติและต้องการปริมาณ CO₂ ที่สูงสำหรับการเจริญเติบโต นอกจากนี้ การสะสม glycolate ในต้นและการสังเคราะห์แสงจะถูกยับยั้งโดยออกซิเจนที่มีความเข้มข้นสูงด้วย จากผลการศึกษาดังกล่าวนี้มีความสอดคล้องกับ ต้นกลายพันธุ์สำหรับการเกิดการหายใจเชิงแสงในพืช C3 ดังนั้นจึงเป็นไปได้ว่ากิจกรรม oxygenation ของ RubisCO แม้จะเกิดในอัตราที่ต่ำในพืช C4 ก็สามารถสร้าง phosphoglycolate (2-PG) ได้และถ้าหากมีการสะสมของ 2-PG ในปริมาณที่มากเพียงพอก็อาจจะเป็นอันตรายต่อเซลล์และสามารถยับยั้งการ สังเคราะห์แสงได้ อย่างไรก็ตาม ยังมีการศึกษาไม่มากนักในเรื่องของพิษที่มีสาเหตุมาจาก 2-PG และสารเมแทบอไลต์ (metabolite) ของการเกิดการหายใจเชิงแสงอื่น ๆ ที่มีต่อการสังเคราะห์แสง ซึ่งดูเหมือนว่าจะมีความสำคัญต่อการยับยั้งการเจริญเติบโตภายใต้สภาพที่มี กิจกรรมของ oxegenation อยู่สูง ซึ่งเป็นผลทำให้สูญเสีย CO₂ และ NH₄⁺ ระหว่างขั้นตอนหลังจากการเกิดการหายใจเชิงแสง

 

ในงานวิจัยที่สอง ได้ศึกษาการเกิด photorespiration ของ cyanobacterium Synechocystis ที่กลายพันธุ์ผลการทดลองมีความคล้ายคลึงกับในข้าวโพด โดยทั่วไปการตรึง O₂ โดย RubisCO จะต่ำมากใน cyanobacteria เนื่องจากประสิทธิภาพของกลไกการสะสมความเข้มข้นของปริมาณ CO₂ ที่ทำงานได้ดี cyanobacteria สามารถจะกำจัด glycolate ส่วนเกินได้ โดยใช้ 3 เส้นทาง (ภาพที่ 8 ด้านล่าง): เส้นทางที่หนึ่ง ได้แก่กระบวนการเมแทบอลิซึมของคาร์บอนที่แบคทีเรียใช้สำหรับเจริญเติบโต เส้นทางที่สองมีความคล้ายคลึงกับวิถีการหายใจทางแสง (photorespiration pathway) ในพืชชั้นสูง และเส้นทางที่สามเกิดจากการออกซิเดชัน ที่สมบูรณ์ของ glycolate เป็น CO₂ ถ้ามีการกลายพันธุ์ในวิถีของแต่ละเส้นทางนั้น จะทำให้แบคทีเรียเกิดความอ่อนแอลง ส่วนการยับยั้งทั้งสามเส้นทางสำหรับการเปลี่ยน glycolate มีผลทำให้เกิดการตายขึ้น ได้มีการเสนอแนะว่ากระบวนการหายใจเชิงแสง (photorespiration) อาจจะมีการพัฒนาก่อนการเกิด endosymbiosis ของ cyanobacteria ที่เป็นต้นกำเนิดของการสังเคราะห์แสงเป็นครั้งแรกในยูแคริโอท และการยับยั้งที่สมบูรณ์ของกลไก phosphoglycolate น่าที่จะทำให้สิ่งมีชีวิตที่สังเคราะห์แสงได้ตายได้ภายใต้สภาพอากาศปกติซึ่ง ไม่ขึ้นกับปริมาณของฟอสโฟไกลโคเลทที่สร้างขึ้น

 

 

 

ภาพที่ 8 กลไกต่าง ๆ ที่เกี่ยวข้องกับ phosphoglycolate metabolism ใน Synechocystis.

 

 

2.3.5 การแสดงออกของยีนในกระบวนการหายใจเชิงแสง

การจำแนกยีนที่ทำงานในกระบวนการหลักของการหายใจเชิงแสง (photorespiration) Arabidopsis (ภาพที่ 9 )ซึ่งเกี่ยวข้องกับวิถีหลักของการหายใจเชิงแสง (core photorespiration pathway) ตารางที่ 1 (ดูที่ด้านล่าง) ในขณะเดียวกันยังมียีนอื่น ๆ อีกมากมายที่ยังไม่ได้มีศึกษา ยีนที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการหายใจเชิงแสงส่วนใหญ่เป็นสมาชิกย่อยในยีนครอบครัวขนาดเล็ก (small gene families) ที่ประกอบด้วยยีนสมาชิกที่ทำงานหลายหน้าที่ไม่เกี่ยวกับการหายใจเชิงแสง(non-photorespiration)ด้วย การศึกษาการแสดงออกของยีนในเนื้อเยื่อและส่วนต่างๆ ของพืช

 

การศึกษาการแสดงออกของยีนในเนื้อเยื่อและส่วนต่าง ๆ ของพืชด้วยโปรแกรม Genevestigator บ่งชี้ว่ายีนที่เกี่ยวข้องโดยตรงและยีนที่อาจจะเกี่ยวข้องกับกระบวนการหายใจเชิงแสงได้จัดอยู่ในกลุ่มเดียวกับยีนที่เกี่ยวกับการตรึงคาร์บอน 2 ยีน คือ RubisCO (Rbcs) และ phosphoribulokinase (PRK) ที่ใช้เป็น marker genes (ภาพที่ 9 ด้านล่าง) ทั้งนี้ยีนที่ทำการศึกษาสามารถจัดเป็นกลุ่มย่อยได้สองกลุ่มโดยอาศัยรูปแบบการแสดงออกของยีนเป็นตัวจำแนก ยีนในกลุ่มแรกประกอบด้วย marker genes ทั้งสอง (RubisCO และ PRK) และยีนทั้งหมดที่แสดงในตารางที่ 1 (ดูที่ด้านล่าง) (ยกเว้น DIT2.1 และ CAT2) ซึ่งยีนที่อยู่ในกลุ่มนี้จะประกอบด้วยยีนที่จำเป็นสำหรับกระบวนการหายใจเชิงแสงหลายยีนที่ไม่สามารถมียีนอื่นมาทดแทนได้ ยกตัวอย่างเช่น hydroxypyruvate reductase 1 (HPR1), glutamine synthetase (GS2), Glycolate Oxidase (GO) สองยีน ยีนที่ควบคุมการสร้างหน่วยย่อยของ glycine decarboxylase (GDC) ซึ่งประกอบด้วย ยีนสำหรับ GDC P subunit (GDLP1) (ที่ทำงานซ้อนทับกันกับยีน GDLP2 ที่ทั้งเกี่ยวข้องและไม่เกี่ยวข้องกับ photorespiration) การวิเคราะห์การแสดงออกของ transcripts ที่น่าจะเกี่ยวข้องกับโปรตีนที่ทำงานในเพอร์ออกซิโซม บ่งชี้ว่ายีน GO ที่เกี่ยวข้องกับ photorespiration น่าจะมีเพียงยีนเดียว แม้ว่าจากการวิเคราะห์ array probe set ได้ตรวจพบการแสดงออกของ GO ทั้ง 2 ยีน แต่ก็มี GO เพียงยีนเดียวที่ถูกจัดเข้าในหมู่ยีนกลุ่มที่ 1 (ภาพที่ 9 ด้านล่าง) ซึ่ง GO ยีนนี้ใน Arabidopsis มีความเหมือนกันมาก (homology) กับยีน GO ในข้าวโพดที่อยู่ใน photorespiratory glycolate metabolism ในกรณีของ HPR นอกจาก HPR1 ถูกพบอยู่ในกลุ่มที่ 1 กิจกรรมของเอนไซม์นี้ได้ที่ไม่ได้เกิดในเพอร์ออกซิโซมก็มีอยู่ด้วยเช่นกัน เช่น HPR2 ถูกคาดหมายว่าจะสร้างเอนไซม์ที่ทำงานในไซโตพลาสซึม และยีน HPR2 ก็ถูกจัดอยู่ในกลุ่มที่ 2 การศึกษาใน Arabidopsis ได้แสดงให้เห็นว่า HPR ทั้งสอง isoforms นี้จะทำงานร่วมกันในการสังเคราะห์ photorespiratory glycerate ถึงแม้ว่าหมู่ยีนที่ถูกจัดอยู่ในกลุ่มที่ 2 จะแสดงออกในเนื้อเยื่อที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์แสง แต่ mRNA ของยีนกลุ่มนี้ยังถูกตรวจพบได้ในเนื้อเยื่อพืชที่ไม่มีส่วนเกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์แสงด้วยเช่นกัน (ภาพที่ 9) ยีนในกลุ่มที่ 2 นอกจากมียีนที่รู้หน้าที่ชัดเจนว่าเกี่ยวข้องกับ photorespiration แล้ว ก็ยังประกอบด้วยยีนอีกหลาย ๆ ยีนที่น่าจะมีหน้าที่ในการส่งเสริม (accessory functions) ในกระบวนการ photorespiration ด้วยเหมือนกัน (Maurino et al., 2010)

 

 

 

 

ภาพที่ 9 รูปแบบการแสดงออกและการจัดกลุ่มยีนย่อยที่มาจาก gene families ที่สร้างเอนไซม์ที่จำเป็นในกระบวนการหายใจเชิงแสง (photorespiration) โดยอาศัยความคล้ายคลึงกันของรูปแบบการแสดงออกของยีนในเนื้อเยื่อและส่วนต่าง ๆ ของพืช Arabidopsis

 

 

 

 

ตารางที่ 1 ยีนที่เกี่ยวข้องกับขบวนการหายใจด้วยแสงและพันธุ์กลายของ Arabidopsis ยีนบางตัวมีความสำคัญมากจนไม่สามารถทดแทนด้วยยีนอื่นได้

Enzyme At gene name Gene Indentity Mutant with photorespiratory phenotype Carbon recycling 1.Phosphoglycolate phosphatase PGLP1 At5g36700 Yes 2.Glycolate oxidase GO At3g14415 At3g14420 No No 3.Serine:glyoxylate aminotransferase SGAT(AGT1) At2g13360 Yes 4.Glutamate:glyoxylate aminotransferase GGT1(AOAT1) GGT2(AOAT1) At1g23310 At1g70580 No No 5.Glycine decarboxylase GDCH1 GDCH2 GLDP1 GLDP2 GDCT At2g35379 At1g32470 At4g33010 At2g26080 At1g11860 No No No No No 6.Serine hydroxymethyltransferase SHM1 At4g37930 Yes 7.Hydroxypyruvate reductase HPR1 HPR2 At1g68010 At1g79870 No No 8.Glycerate kinase GLYK At1g80380 Yes Nitrogen recycling 9.Glutamine synthetase GS2 At5g35630 No 10.Glutamate synthetase(Fd-GOGAT) GLU1 At5g04140 Yes 11.Chloroplast envelope transporters DiTl DiT2.1 DiT2.2 At5g12860 At5g64290 At5g64280 No Yes No H2O2 metabolism 12.Catalase CAT2 At4g35090 Yes

 

 

2.3.6. การแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการหายใจเชิงแสง (deleted)

ถึงแม้ว่าหน้าที่สำคัญของการเกิดการหายใจเชิงแสงในพืชคือการตอบสนองต่อสภาพเครียด แต่ยังมีข้อมูลที่ยังจำกัดต่อการศึกษายีนที่เกี่ยวข้องกับการเกิดการหายใจเชิงแสงที่ตอบสนองต่อสภาวะเครียด สามแบบใน Arabidopsis รูปการแสดงออกของยีน (transcriptional profile) ที่วิเคราะห์จากโปรแกรม Genevestigator (Foyer et al. 2009) เกี่ยวกับยีนที่มีต่อการตอบสนองอย่างน่าสนใจต่อสภาพแวดล้อมใน 3 สภาวะเครียด (osmotic stress, light, และ low nitrate)

สรุปได้ว่ามีหลักฐานความเกี่ยวข้องที่ไม่มากนักเกี่ยวกับการแสดงออกของยีนที่จำเพาะกับการเกิดการหายใจเชิงแสง ภายใต้สภาวะเครียดและและยังไม่มีผลการศึกษาในพืชกลายพันธุ์และ/หรือพืชดัดแปลงพันธุกรรมมากนัก

 

 

 

2.3.7. การผสมผสานของ metabolic pool ในกระบวนการ photores piration

การพยายามที่ลดบทบาท (down-regulate) เส้นทางหลักของกระบวนการหายใจเชิงแสง ( photorespiration) ซึ่งเข้าใจกันว่าเส้นทางนี้ไม่มีหน้าที่สำคัญยกเว้นการทำหน้าที่หมุนเวียนคาร์บอนใน glycolate โดยเปลี่ยนกลับไปเป็น glycerate ซึ่งในความจริงเส้นทางหลักของกระบวนการ photorespiration นี้ได้ถูกเสนอขึ้นมาเมื่อหลายปีมาแล้วโดยเกี่ยวข้องกับ metabolic channeling โดยเฉพาะอย่างยิ่งภายในเพอร์ออกซิโซมมี ตัวขนส่ง (transporters) ที่ใช้ในการลำเลียงซึ่งส่งผ่านไปยังช่องทางต่าง ๆ ผ่านการแลกเปลี่ยนแบบ stoichiometric ของ metabolites อย่างเช่น glycolate และ glycerate เป็นต้น ซี่งกระบวนการนี้ได้ถูกศึกษาแล้วในระดับชีวเคมี อย่างไรก็ตามเฉพาะตัวขนส่ง (transporters) ซึ่งได้แก่ chloroplast translocators ที่เกี่ยวข้องกับการแลกเปลี่ยน glutamate/2-oxoglutarate เท่านั้นที่ได้ถูกศึกษาในระดับพันธุศาสตร์และระดับโมเลกุลแล้ว

 

 

 

2.4. การพัฒนาระบบกลุ่มเซลล์เฉพาะทางแบบ Kranz Anatomy ในพืชC4

ระบบการสังเคราะห์แสงแบบ C4 เป็นระบบที่ประกอบไปด้วยลักษณะอีกหลายลักษณะที่จำเป็นต้องปรากฏพร้อมกันได้แก่ 1) ลักษณะทางชีวเคมี 2)ลักษณะทางโครงสร้าง และ 3) ลักษณะการควบคุมการแสดงออกของยีน

2.4.1. ลักษณะโครงสร้างภายในใบแบบ Kranz (Kranz anatomy) ของพืช C4:

ในพืช C4 ทั้งใบเลี้ยงเดี่ยวและใบเลี้ยงคู่ ได้มีการจำแนกลักษณะทางกายภาพที่แตกต่างกันออกไปได้ถึง 14 แบบ (Dengler and Nelson, 1999) ทว่าลักษณะที่พืช C4 ส่วนใหญ่จะมีเหมือน ๆ กันคือ ลักษณะทางโครงสร้างของใบที่เรียกว่าโครงสร้างแบบ Kranz (Kranz anatomy) โดยลักษณะดังกล่าวคือการที่มีกลุ่มของเซลล์สองกลุ่มเรียงตัวเป็นวงสองวงล้อมรอบมัดท่อลำเลียง (veins) โดยมีวงในอยู่ชิดติดกับกลุ่มท่อลำเลียง เรียกเซลล์กลุ่มนี้ว่าเซลล์ bundle sheath (BS) ภายในเซลล์ BS จะประกอบไปด้วยคลอโรพลาสต์จำนวนมากและคลอโรพลาสต์เหล่านี้เป็นชนิดที่ไม่มีกรานา (agrana) ถัดออกมาเป็นวงนอกจะมีเซลล์อีกกลุ่มหนี่งคือเซลล์ mesophyll (M) จะล้อมเซลล์ BS เอาไว้ ในเซลล์ M ของพืช C4 จะไม่พบคลอโรพลาสต์หรือพบน้อยมาก (ภาพที่ 5 ด้านล่าง) ลักษณะการเรียงตัวของเซลล์ทั้งสองชนิดดังกล่าวมีข้อดีหลายประการ เช่น เป็นการแบ่งส่วนกันอย่างชัดเจนระหว่างส่วนของการดักจับและตรึงคาร์บอนไดออกไซด์ (carbon fixation) ซึ่งเกิดขึ้นในส่วนของเซลล์ M และส่วนของการใช้คาร์บอนไดออกไซด์ (carbon assimilation) ไปในกระบวนการสังเคราะห์แสงในเซลล์ BS ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ (CO2) และก๊าซออกซิเจน (O2) จากภายนอกผ่านเข้าทางปากใบไปสู่เซลล์เมโซฟิลล์ซึ่งจะมีเอนไซม์ carbonic anhydrase (CA) คอยจับ CO2 และเปลี่ยนให้อยู่ในรูปของไบคาร์บอเนต (HCO3-) ในเซลล์ M ยังมีเอนไซม์ที่ใช้ในการตรึง CO2 คือ PEPC ที่มีความจำเพาะกับCO2 (ที่อยู่ในรูป HCO3-) เท่านั้น ดังนั้นถึงแม้ว่าจะมี O2 ซึ่งเข้ามาทางปากใบพร้อมกันกับ CO2 ปรากฎอยู่ด้วยก็ตาม ก็ไม่มีผลในการเข้าไปแก่งแย่งทำปฏิกิริยาดังเช่นที่เกิดในส่วนของเซลล์เมโซฟิลล์ในพืช C3 ทำให้พืช C4 สามารถตรึง CO2 ในส่วนนี้ได้อย่างเต็มที่ นอกจากนี้การที่เซลล์ BS ล้อมรอบมัดท่อลำเลียงไว้ ทำให้การขนส่งผลิตภัณท์ที่ได้จากการสังเคราะห์แสงในเซลล์ BS สามารถส่งต่อไปทางท่อลำเลียงได้อย่างรวดเร็ว ซึ่งผิดกันกับในพืช C3 ที่การสังเคราะห์แสงเกิดขึ้นในเซลล์ M ซึ่งต้องใช้เวลาในการขนส่งจากเซลล์ต่อเซลล์ไปสู่ท่อลำเลียงได้ช้ากว่า และการที่เซลล์ BS มีผนังหนาอันเนื่องมาจากมีการสะสมของซูเบอริน (suberin) ทำให้สามารถกักขัง CO2 ที่ปลดปล่อยมาจากสารประกอบที่มีคาร์บอน 4 อะตอมเอาไว้ได้มากจึงทำให้เอนไซม์ RubisCO สามารถนำไปใช้ได้อย่างเต็มที่และลดการเกิดการหายใจเชิงแสง

 

 

ภาพที่ 5 โครงสร้างแบบ Kranz และขบวนการตรึงคาร์บอนไดออกไซด์แบบ C4 (a) โครงสร้างแบบ Kranz ที่พบโดยทั่วไปในใบพืช C4 ใบเลี้ยงเดี่ยว จะเห็นว่ามีคลอโรพลาสต์จำนวนมากในเซลล์ bundle sheath (BS) เมื่อเทียบกับเซลล์ mesophyll (M) (b) กระบวนการสังเคราะห์แสงแบบ C4 ชนิด 2 cell อย่างง่าย แสดงถึงการเกิดขบวนการ carboxylation, decarboxylation และ reassimilation reactions ที่เกิดขึ้นภายในเซลล์อักษรย่อ: v, vascular centre; bs, bundle sheath cells; mp, mesophyll cells; e, upper or lower leaf epidermal cells. ที่มา: James O Berry และ Minesh Patel, 2008

เนื่องด้วยประสิทธิภาพในการตรึง CO2 ที่สูงกว่าและกระบวนการหายใจเชิงแสง (photorespiration) ที่ถูกยับยั้ง จึงทำให้พืชในกลุ่ม C4 มีการสูญเสีย CO2 น้อยกว่าในพืชกลุ่ม C3 ซึ่งหมายความว่าการตรึง CO2 ในระบบปิดนั้นพืชในกลุ่ม C4 สามารถรักษาอัตราการดูดซึมCO2 เมื่อความเข้มข้นของ CO2ในอากาศลดลงอย่างมีนัยสำคัญ และยังพบว่าพืชในกลุ่ม C4 มีจุดอิ่มตัวของ CO2 ที่ต่ำกว่าพืชกลุ่ม C3 แต่ในสภาวะที่มี O2 ต่ำประสิทธิภาพของการสังเคราะห์แสงในพืชกลุ่ม C4 ลดลงเมื่อเทียบกับพืชในกลุ่ม C3 (Hatch, 1987; Kani and Edwards, 1999; Von Caemmerer and Furbank, 2003; Sage, 2004)

 

 

2.4.2. ชีววิทยาด้านการพัฒนาของเซลล์และความจำเพาะต่อเนื้อเยื่อของยีนและเอนไซม์

ในพืชใบเลี้ยงเดี่ยวการพัฒนาของโครงสร้าง Kranz แปรผันไปตามระยะการเจริญเติบโตของใบพืช โดยบริเวณที่แก่ที่สุดของใบซึ่งจะอยู่ตรงส่วนปลายของใบ (tip) จะมีการพัฒนาโครงสร้างแบบ Kranz แล้วอย่างสมบูรณ์ ในขณะที่บริเวณส่วนที่อ่อนกว่าของใบซึ่งอยู่ใกล้กับส่วนฐาน (base) จะยังไม่มีการพัฒนาโครงสร้าง Kranz หรือกำลังอยู่ในช่วงของการพัฒนาโดยระดับของการพัฒนาจะลดหลั่นกันไปตามระยะการพัฒนาของใบ ในขณะที่พืชใบเลี้ยงคู่พบว่าการพัฒนาโครงสร้างแบบ Kranz ในใบไม่มีความแตกต่างกันมากนัก (Nelson and Langdale, 1992; Berry et al., 1997; Dengler and Nelson, 1999; Patel and Berry, 2008)

การพัฒนาประสิทธิภาพของการสังเคราะห์แสงแบบ C4 ของทั้งพืชใบเลี้ยงเดี่ยวและใบเลี้ยงคู่นั้นมีความสัมพันธ์สอดคล้องกับการพัฒนาของโครงสร้างแบบ Kranz ต้นกำเนิดของเซลล์ mesophyll (M) ในพืช C4 มีความคล้ายคลึงกับในเซลล์ chlorenchyma ของพืช C3 ในขณะที่เซลล์ bundle sheath (BS) มีการพัฒนามาจากทั้งเนื้อเยื่อ meristem และเซลล์ procambium (ขึ้นอยู่กับชนิดของพืช) ที่อยู่ใกล้กับบริเวณที่มีการพัฒนาระบบท่อลำเลียงของใบ (leaf vein) ระบบท่อลำเลียงของใบพัฒนามาจาก procambium ก่อนการเกิดของเซลล์ BS และเป็นบริเวณที่มีการพัฒนาของเซลล์ BS การผลิตของเอนไซม์ที่จำเพาะกับพืช C4 (เช่นเอนไซม์ PEPC ที่พบในเฉพาะเนื้อเยื่อ M) จะเริ่มมีการผลิตก็ต่อเมื่อมีการเริ่มพัฒนาเนื้อเยื่อชั้น BS และ M และเอนไซม์อื่น ๆ ในระบบพืช C4 ส่วนมากจะมีความสัมพันธ์กับความสมบูรณ์ของการพัฒนาเซลล์ที่ใช้ในกระบวนการสังเคราะห์แสง

บางกรณีการพัฒนาของใบพืชกลุ่ม C4 สัมพันธ์กับการแสดงออกของยีน RubisCO การผลิตและการเคลื่อนย้ายของเอนไซม์ RubisCO สู่เซลล์ BS จะมีขึ้นเมื่อมีการพัฒนาโครงสร้าง Kranz อย่างสมบูรณ์แล้ว Patel and Berry (2008) พบว่าในตอนเริ่มต้นของการพัฒนาในขณะที่พืช C4 ใบเลี้ยงเดี่ยว (ข้าวโพด) และพืช C4 ใบเลี้ยงคู่ (amaranth) ยังมีรูปแบบของเซลล์คล้ายกับ C3 (C3-like) เอนไซม์ RubisCO สามารถตรวจพบได้ทั้งในเซลล์ BS และเซลล์ M หลังจากนั้นในการพัฒนาขั้นต่อมาจะเป็นการพัฒนาของการเกิดเป็นลักษณะ C4 (C4-type) ซึ่งในตอนนี้จะสามารถตรวจพบเอนไซม์ RubisCO ได้ในเซลล์ BS เท่านั้น ซึ่งเหตุการณ์จะเกิดขึ้นสัมพันธ์กับขั้นตอนการพัฒนาของโครงสร้างของใบอย่างจำเพาะ และสามารถใช้เป็นการอ้างอิงถึงการเปลี่ยนจากสถานะ C3ไปเป็น C4 ในแง่ของการแสดงออกของยีน RubisCO เมื่อทดสอบข้าวโพดในสภาพไร้แสง สามารถพบเอนไซม์ RubisCO ได้ทั้งในเซลล์ BS และเซลล์ M แต่จะพบอย่างจำเพาะในเซลล์ BS เมื่อพืชได้รับแสง ส่วนในพืชใบเลี้ยงคู่ amaranth ความจำเพาะของเอนไซม์ RubisCO ต่อเซลล์ BS ไม่ได้ขึ้นอยู่กับแสงแต่กลับมีความสัมพันธ์กับการส่งถ่ายคาร์บอนจากแหล่งกำเนิดซึ่งเป็นกระบวนการพัฒนาที่พืชใบเลี้ยงคู่เปลี่ยนคาร์บอนที่รับเข้ามาสุทธิเป็นคาร์บอนที่ส่งออกด้วยขบวนการตรึงคาร์บอนด้วยแสง ซึ่งแสดงให้เห็นว่ามีตัวควบคุมกลไกที่แตกต่างกันออกไปที่มาควบคุมการแสดงออกของยีน RubisCO ที่ทำงานจำเพาะกับเซลล์ในระหว่างพืชกลุ่ม C4 ใบเลี้ยงเดี่ยวและใบเลี้ยงคู่ แต่อย่างไรก็ตาม ก็ยังมีความเป็นไปได้ว่าอาจจะมีกลไกเดียวกันที่ควบคุมการเปลี่ยนสถานะจาก C3 ไปเป็น C4 ในพืชทั้งสองชนิดนี้ การเปลี่ยนแปลงของสถานะของเซลล์จากเซลล์แหล่งรับ (sink) เป็นเซลล์แหล่งผลิต (source) ใน amaranth หรือการเริ่มของกระบวนการสังเคราะห์แสงภายใต้สภาพมีแสงในข้าวโพด สามารถส่งผลต่อการเคลื่อนที่ของตัวส่งสัญญาณที่คล้ายคลึงกัน ซึ่งอาจส่งผลทั้งทางตรงหรือทางอ้อมต่อรูปแบบของการแสดงออกของยีน rbcL และRbcS ซึ่งเป็นยีนที่ผลิตองค์ประกอบของเอนไซม์ RubisCO ในใบของพืชกลุ่ม C4 เพื่อสนับสนุนสมมุติฐานนี้ ได้มีการศึกษาพบว่าในพืชหลายชนิดการแสดงออกของยีน RibisCO ถูกควบคุมด้วยกระบวนการในการสังเคราะห์แสง (Patel and Berry, 2008)

 

 

 

2.4.2.1. วิถีทางชีวเคมีของ C4 กับ Kranz Anatomy

วิถีทางชีวเคมีแบบ C4 (C4 pathway) ถูกค้นพบครั้งแรกเมื่อปี ค.ศ. 1966 โดย Dr.Marshall Davidson Hatch and C. R. Slack ในประเทศออสเตรเลีย ในช่วงนั้น pathway นี้จะถูกเรียกว่า Hatch-Slack pathway (Slack and Hatch, 1967) ปฏิกิริยาในขั้นตอนแรกของ pathway คือการเปลี่ยนสาร pyruvate ไปเป็นสาร phosphoenolpyruvate (PEP) โดยเอนไซม์ pyruvate orthophosphate dikinase (PPDK) ปฏิกิริยาในขั้นตอนนี้ต้องใช้ inorganic phosphate (Pi) และสารพลังงานสูง ATP รวมทั้ง pyruvate ในการผลิต PEP และจะได้ adenosine monophosphate (AMP) กับ pyrophosphate (PPi) เกิดขึ้นมาจากปฏิกิริยา ขั้นตอนต่อไปคือการตรึง CO₂ เข้าสู่ PEP ด้วยเอนไซม์ PEP carboxylase (PEPC) ขั้นตอนทั้งสองเกิดขึ้นในเซลล์ mesophyll (M) ทั้งนี้เอนไซม์ PEPC มีค่า Km สำหรับ CO₂ ต่ำกว่า RuBisCO ดังนั้นจึงทำให้เกิดปฏิกิริยาได้ง่ายกว่า นอกจากนี้ O₂ เป็นสารตั้งต้นที่เลวสำหรับหรับเอนไซม์นี้ ดังนั้นในภาวะที่มีความเข้มข้นของ CO₂ ค่อนข้างต่ำ CO₂ เกือบทั้งหมดจะถูกตรึงด้วยวิถีนี้ ผลผลิต (product) ที่ได้โดยมากแล้วจะถูกเปลี่ยนไปเป็นสาร malate ซึ่งเป็นสารชีวอินทรีย์พื้นฐาน และจะถูกขนส่งต่อไปยังเซลล์ bundle sheath (BS) ที่อยู่ล้อมรอบใกล้ชิดติดกับท่อลำเลียง (veins) จากนั้น malate จะถูกทำให้เกิดการ decarboxylate เพื่อให้ได้ผลผลิตคือ CO₂ และpyruvate แล้วในที่สุด CO₂ จะเข้าไปสู่วัฏจักรคัลวินและ pyruvate ก็จะถูกขนส่งกลับไปยังเซลล์ M ด้วยเหตุที่ทุก ๆ โมเลกุลของ CO₂ จะต้องถูกตรึงสองครั้งด้วยกัน โดยถูกตรึงครั้งแรกโดยสารอินทรีย์ที่มีคาร์บอน 4 อะตอม และครั้งที่สองโดย RubisCO จึงทำให้ C4 pathway ใช้พลังงานมากกว่า C3 pathway ในขณะที่ C3 pathway ต้องการสารพลังงานสูง ATP จำนวน 18 โมเลกุลสำหรับการสังเคราะห์หนึ่งโมเลกุลของกลูโคส แต่ C4 pathway ต้องการถึง 30 โมเลกุลของสาร ATP แต่การใช้พลังงานที่มากกว่านี้ก็ถือได้ว่าคุ้มค่าเพราะเป็นการแลกกับการไม่ต้องสูญเสียคาร์บอนปริมาณหนึ่งที่ไปในการหายใจเชิงแสง (photorespiration)

 

 

 

2.4.2.2. กลุ่มย่อยของพืช C4 (C4 subgroups)

พืช C4 สามารถแบ่งออกได้เป็น 3 กลุ่มย่อย คือ 1) ชนิด NADP-ME 2) ชนิด NAD-ME และ 3) ชนิด PEP-CK ตามความแตกต่างของเอนไซม์ที่ใช้ในขั้นตอนของการ decarboxylation ในเซลล์ BS (ภาพที่ 11) พืช C4 ในแต่ละชนิดของกลุ่มย่อยจะมีความแตกต่างกันของรูปร่างและการจัดเรียงตัวของคลอโรพลาสต์ในเซลล์ BS และยังมีความแตกต่างกันทางด้านชีวเคมีระหว่างเซลล์ M และเซลล์ BS รวมถึงวิธีการในการขนส่งเมแทบอไลต์ (metabolites) ระหว่างเซลล์ด้วย

ภาพที่ 11

 

NADP-ME Type: พืช C4 ตระกูลหญ้าที่อยู่ในกลุ่มนี้จะมีคลอโรพลาสต์ในเซลล์ BS จัดเรียงตัวในรูปแบบหนีห่างจากกลุ่มท่อลำเลียง (centrifugal position) และมีเยื่อหุ้มไธลาคอยด์ ( thylakoid membranes) ที่ไม่ค่อยปรากฎส่วนของชั้นกรานา (grana stack) คลอโรพลาสต์ที่อยู่ในเซลล์ M และเซลล์ BS จะมีบทบาทสำคัญใน C4 pathway สาร oxaloacetate (OAA) ที่สร้างโดยเอนไซม์ PEPC ในไซโตพลาสซึม จะถูกขนส่งมายังคลอโรพลาสต์ในเซลล์ M สาร OAA ส่วนมากจะถูกรีดิวซ์ (reduced) ให้เป็น malate (MA) โดยเอนไซม์ NADP-specific malate dehydrogenase (NADP-MDH) และส่วนที่เหลือจะถูกเปลี่ยนไปเป็นaspartate โดยเอนไซม์ aspartate aminotransferase ผลิตผลที่เป็นกรด (acids) เหล่านี้จะถูกขนส่งออกจากเซลล์ M ไปยังเซลล์ BS โดยผ่านทางรูพรุน plasmodesmata ซึ่งมีอยู่มากในบริเวณที่เซลล์ทั้งสองชนิดสัมผัสกัน สำหรับปฏิกิริยาในส่วนของคลอโรพลาสต์ในเซลล์ BS สาร malate จะถูก decarboxylated โดยเอนไซม์ NADP-malic enzyme (NADP-ME) เพื่อป้อน CO₂ และ reduced-NADP เข้าสู่วัฏจักร PCR ส่วนผลผลิตที่ได้จากการ decarboxylation คือ pyruvate จะถูกส่งกลับไปยังคลอโรพลาสต์ในเซลล์ M ซึ่งจะถูก phosphorylate โดยเอนไซม์ pyruvate orthophosphate dikinase (PPDK) เพื่อสร้างเป็น PEP ซึ่งเป็นตัวรับคาร์บอน (inorganic carbon) ต่อไป การเกิด decarboxylation โดยเอนไซม์ NADP-ME นี้อาจจะเกิดขึ้นได้โดยผ่านaspartate ซึ่งจะถูกเปลี่ยนไปเป็น malate โดยเอนไซม์ aspartate aminotransferase และเอนไซม์ malate dehydrogenase ได้ด้วย

 

 

 

 

2.4.3. การควบคุมการแสดงออกของยีนและโปรตีนที่ต้องการใน Kranz Anatomy

1) Carbonic Anhydrase (CA)

2) Phosphoenolpoyruvate Carboxylase (PEPC)

3) PEPC Kinase

4) การควบคุมการแลกเปลี่ยน OAA กับ Malate ผ่านคลอโรพลาสต์ในเซลล์เมโซฟิลล์

5) Malate Dehydrogenase

6) C4-Acid Decarboxylases

7) การควบคุมการแสดงออกของ RuBisCO

- การควบคุมการแสดงออกของ SSU

- ยีนที่ถอดรหัส SSU ใบพืช C4 ใบเลี้ยงคู่

- การควบคุมของยีน rbcL ต่อการสร้างโปรตีน LSU (Regulation of rbcL Encoding LSU)

8) ยีนที่ควบคุมการสร้างโปรตีนใน Thylakoid Membranes

9) Pyruvate Orthophosphate Dikinase

10) Global Regulators of C4 Gene Expression

 

 

 

3.1 ความสำคัญและความจำเป็นในการพัฒนาข้าวไปสู่พืชC4

 

ข้าว (Oryza sativa) เป็นพืชเศรษฐกิจที่สำคัญของโลกและเป็นอาหารหลักของประชากรมากกว่าครึ่งหนึ่งของประชากรโลก ปัจจุบันข้าวยังเป็นที่ต้องการของตลาดทั้งภายในประเทศและต่างประเทศ แต่ผลผลิตของข้าวที่ได้ต่อไร่นั้นยังต่ำอยู่ ยกตัวอย่างเช่นที่ประเทศจีน ผลผลิตข้าวเฉลี่ยต่อปีเพิ่มจาก 5.4 t/ha เป็น 6.4 t/ha ระหว่างปี 1987 และ 1997 ซึ่งใช้เวลาเกือบ 10 ปีและยังไม่สามารถเพิ่มผลผลิตให้มากกว่านี้ได้ ในระหว่างปี 1997 ถึง 2007 (Peng et al. 2009) จึงมีการปรับปรุงพันธุ์ข้าวให้มีผลผลิตที่สูงขึ้นโดยใช้เทคนิคต่าง ๆ รวมทั้งเทคนิคสมัยใหม่ทางด้าน molecular biology ดังที่ทราบกันดีว่าการเพิ่มกลไกในกระบวนการสังเคราะห์แสงนั้นเป็นพื้นฐานในการเพิ่มผลผลิต นักปรับปรุงพันธุ์ส่วนใหญ่จึงมุ่งเน้นปรับปรุงพันธุ์โดยเพิ่มกระบวนการสังเคราะห์แสงให้ข้าวเพื่อที่จะได้ผลผลิตที่มากกว่าเดิม นอกจากนี้อาจทำให้พืชสามารถใช้น้ำและไนโตรเจนได้อย่างมีประสิทธิภาพอีกด้วย (Miyao, 2003) เป็นที่น่าสนใจว่าถ้าพืช C3 ถูกตัดแต่งพันธุกรรมให้มีอัตราการสังเคราะห์แสงคล้ายพืช C4 อาจจะช่วยให้ข้าวมีอัตราการสังเคราะห์แสงเพิ่มขึ้นและมีผลผลิตที่เพิ่มขึ้น นอกจากนี้การคัดเลือกพันธุ์ที่ทนต่ออุณหภูมิสูงและแสงแดดที่มากกว่าปกติ อาจจะช่วยในการคัดเลือกสายพันธุ์ที่ให้ผลผลิตที่มากกว่าเดิมได้

 

ในตอนนี้มีอยู่ 2 สมมติฐานที่เกี่ยวกับกระบวนการสังเคราะห์แสงแบบ C4 สมมติฐานที่หนึ่งเสนอว่า C4 phtotosynthesis มีการวิวัฒนาการอย่างช้า ๆ ยกตัวอย่างเช่นพืช C3 เปลี่ยนแปลงเป็น C4 แบบค่อยเป็นค่อยไป และสุดท้ายเปลี่ยนรูปแบบการสังเคราะห์แสงไปเป็น C4 photosynthesis (Sage 2004) เรียกสมมติฐานนี้ว่า “incremental gain” ยกตัวอย่างเช่น การลดลงของพื้นที่ระหว่างเส้นใบและกระตุ้น BS ส่วนมากจะสังเกตเห็นได้ในพืชที่ปรับตัวให้เข้ากับความแห้งแล้งโดยเฉพาะบางสายพันธุ์ที่มีลักษณะใกล้เคียงกับพันธุ์ C4 (Sage 2001; Sanchez-Acebo 2005) เป็นที่น่าตื่นเต้นเมื่อพบพืช Parthenium hysterophorus (L.) มีลักษณะกายภาพของ Kranz (Hegde and Patil 1981) อีกสมมติฐานแย้งว่า C4 photosynthesis มีวิวัฒนาการมาจาก mutation คือสมมติฐาน “master switch” ความเหมือนกันของชีวเคมีของระบบ C4 และกายวิภาคแบบ Kranz ในพืชเหล่านั้น แสดงให้เห็นว่าเหตุการณ์ mutation อาจจะเป็นอาการผิดปกติแบบ C4 syndrome งานวิจัยทั้งสองแบบนี้เน้นที่ต้องตัดแต่งพันธุกรรมข้าว ตามแบบของสมมติฐานสองแบบนี้ ถ้าจะวิจัยเน้นที่สมมติฐานแบบ “incremental gain” โดยการสร้างข้าว C4 ต้องการการตัดแต่งพันธุกรรมองค์ประกอบที่สำคัญของ C4 photosynthesis เกือบทั้งหมด ลงไปยังพันธุ์ข้าว แล้วศึกษากายวิภาคของใบและกระบวนการขนส่งที่เกี่ยวข้องที่จำเป็นต่อ C4 photosynthesis ซึ่งจะช่วยให้เข้าถึงการควบคุมทางพันธุกรรมของกายวิภาคแบบ Kranz การก่อตัวของคลอโรพลาสต์ และรายละเอียดในการควบคุมกระบวนการเผาผลาญและขนส่งระดับเซลล์ สำหรับงานวิจัยที่เน้นสมมติฐานแบบ “master switch” นั้นสร้างข้าว C4 โดยการจำแนกยีนที่ต้องการสำหรับการเชื่อมโยงต่อการเกิด C4 ในกระบวนการ differentiation

 

 

 

ในปี 2006 ได้มีการประชุมซึ่งจัดโดยสถาบันวิจัยข้าวนานาชาติ (IRRI) เพื่อระดมความคิดในการพัฒนาข้าว C4 (Sheehy et al., 2007) ซึ่งได้มีการนำเสนอ 2 แนวทางคือ แบบเซลล์เดียว (single-cell model) และแบบสองเซลล์ (two-cell model)

 

Single-cell model: การสังเคราะห์แบบเกิดขึ้นภายในเซลล์เดียวนี้ได้ถูกแนะนำครั้งแรกในปี 1990 (Burnell, 1990) ในแบบนี้ส่วนของ cytosol และคลอโรพลาสต์จะทำหน้าที่เลียนแบบเซลล์ M และเซลล์ BSของพืช C4 เอนไซม์ CA และ PEPC จะต้องแสดงออกใน cytosol และ PPDK กับเอนไซม์ที่ใช้ในการ decarboxylation กรด C4 ต้องให้แสดงออกในคลอโรพลาสต์ สิ่งที่น่าดึงดูดใจของโมเดลนี้คือความเรียบง่ายของการออกแบบเมื่อเปรียบเทียบกับโมเดลชนิดสองเซลล์ที่ต้องการ Kranz anatomy

 

 

 

โมเดลแบบสองเซลล์ก็คือการสังเคราะห์แสงแบบ C4 ที่ต้องอาศัย Kranz anatomy นั่นเอง โมเดลชนิดนี้ต้องคำนึงถึงปัจจัยเกี่ยวข้องหลายประการ ความพยายามในการพัฒนาข้าว C4 ในอดีตจนถึงปัจจุบันยังไม่ได้คำนึงถึงความจริงที่ว่าเอนไซม์ที่เกี่ยวข้อง กับกระบวนการสังเคราะห์แสงนั้นถูกควบคุมด้วยกลไกการควบคุมการแสดงออกของยีน ที่มีลักษณะเฉพาะหลาย ๆ กลไก อาทิเช่น เอนไซม์ PEPC และเอนไซม์ PPDK นั้นถูกควบคุมด้วยกระบวนการ phosphorylation/dephosphorelation ที่แตกต่างกัน ในสภาวะที่มีแสง PEPC จะถูก phosphorylated ทำให้เอนไซม์มีความไวต่อการยับยั้งการทำงานของ malate และ aspartate น้อย และมีความไวต่อการกระตุ้นโดย glycine ได้มากกว่า (Izui et al., 2004) การทำให้ PEPC แสดงออกของในใบข้าว โดยที่ไม่ได้มีการทำให้เกิดการแสดงออกของ PEPC kinase และ PEPC phosphatase พร้อมกันไปด้วยนั้น ทำให้ต้นข้าวที่มีระดับการแสดงออกของ PEPC สูงได้ก็จริงแต่เป็นเอนไซม์ที่ไม่สามารถ catalyze ปฏิกิริยา PEP caboxylation ได้อย่างเต็มศักยภาพเพราะไม่ได้ผ่านการ activate ที่สมบูรณ์ ในทำนองเดียวกัน PPDK ถูกควบคุมโดยกลไก phosphorylation/dephosphorylation อันหนึ่งซึ่งตอบสนองต่อ adenylate energy charge โดยภายใต้สภาวะที่มีแสงน้อย (low light) และมี adenylate energy charge ต่ำ PPDK จะถูก phosphorylate แต่ไม่ทำงาน (inactive) เอนไซม์นี้จะถูกกระตุ้นภายใต้สภาวะที่มี adenylate energy สูง และถูก dephosphorylated (Chastain and Chollet, 2003) การทำให้ PPDK มีการแสดงออกในคลอโรพลาสต์ของใบข้าวโดยไม่มีการแสดงออกของ PPDK regulatory protein ด้วยนั้น อาจทำให้เกิด unregulated hydrolysis ของ ATP ดังนั้นการถ่ายยีน C4 เข้าสู่ข้าวโดยไม่ได้คำนึงถึงปัจจัยเหล่านี้อาจทำให้เกิดความไม่สมดุลและมี ผลในทางลบต่อการเจริญเติบโตของต้นพืช ดังเช่นในพืชที่ได้รับการถ่ายยีน NADP-ME มีสภาพแคระแกร็น (stunt) (Tsuchida et al., 2001) ในทำนองเดียวกัน Taniguchi และคณะ(2008) ได้ทำให้ PEPC และ PPDK ที่ได้จากข้าวโพด, NAPDH-ME จากข้าว, และ NADP-MDH จากข้าวฟ่างมีการแสดงออกมากขึ้นในข้าว พวกเขาพบว่า PPDK และ MDH ที่สร้างจากยีนที่ถูกส่งถ่ายเข้าไปนั้น จะมีสภาพ active เฉพาะตอนกลางวัน ในขณะที่ PEPC กับ ME มีสภาพ active ทั้งในช่วงกลางวันและกลางคืน ต้นข้าวที่การแสดงออกของ PEPC เป็นปริมาณมาก ๆ นั้น มีสภาพแคระแกร็น นักวิจัยได้แนะนำว่าอาการแคระแกร็นอาจรักษาได้หากลดปริมาณของ PEPC protein Kajala และคณะ (2011) ได้สืบค้นและสรุปประเด็นในการพัฒนาข้าว C4 โดยใช้ระบบ two-cell model ที่กำลังดำเนินการโดย C4 Rice Consortium แนวทางสองแนวทางดังกล่าวได้แก่การทำ metabolic C4 engineering และการค้นหายีนและปัจจัยควบคุมลักษณะทางกายภาพของใบโดยใช้ประชากรพืชกลาย พันธุ์ ในการทำ C4 engineering นี้ได้มีการใช้ยีนจากข้าวโพดเพื่อส่งถ่ายและให้มีการแสดงออกในข้าว ในขณะเดียวกันก็มีการยับยั้งการแสดงออกของยีนที่มีอยู่เดิมในข้าว ในการทำ C4 engineering ของโครงการ C4 Rice Project สามารถแบ่งออกได้เป็นสามขั้นตอน ในขั้นตอนแรกของโครงการจะเป็นการส่งถ่ายยีนหลัก ๆ ที่อยู่ในระบบ C4 metabolism ให้กับข้าว และให้ยีนเหล่านั้นทำงานได้ในลักษณะจำเพาะต่อเซลล์ชนิด BS หรือ M เหมือนกับที่อยู่ในพืช C4 นอกจากนี้ยังมีการยับยั้งการแสดงออกของยีนที่อยู่ในวัฏจักรคัลวินบางยีนที่ มีการแสดงออกในเซลล์ M ด้วย โดยใช้เทคนิคการยับยั้งการแสดงออกของยีนแบบ artificial microRNA (amiRNAs) ซึ่งในขณะนี้ได้มีการใช้ amiRNAs ในการยับยั้งการแสดงออกของยีน RubisCO ชนิด small subunit (RbcS) ที่อยู่ในเซลล์ M แล้ว นอกจากนี้ยังมีแนวคิดในการเปลี่ยนตำแหน่งการเกิดการหายใจเชิงแสง (photorespiration) ให้เกิดปฏิกิริยาในเซลล์ BS ในใบของพืช C3 แทนการเกิดปฏิกิริยาในเซลล์ M เพื่อให้ Rubisco ให้เซลล์ M ได้ถูกนำไปใช้ในการสังเคราะห์แสงได้อย่างเต็มที่ ในการทดสอบแนวความคิดดังกล่าวได้มีการใช้ amiRNA ที่มียีนเป้าหมายคือ glycine decarboxylase subunit H (GDC-H) เพื่อลดการแสดงออกของยีนนี้ในเซลล์ M ขั้นที่สองของโครงการคือการเพิ่มตัวขนส่ง (transporters) ที่ใช้ในการขนส่งผลิตผลในกระบวนการสังเคราะห์แสงแบบ C4 เข้าไปในข้าว เพื่อให้การขนส่งผลผลิตที่มีการสร้างขึ้นในเซลล์ M และเซลล์ BS เป็นไปได้อย่างสะดวก ตัวขนส่งเหล่านี้ได้มาจากข้าวโพดประกอบด้วย OAA/malate antiporter (OMT1), putative dicarboxylate transporters (DiT1 and DiT2) และ PEP/phosphate translocator (PPT1) และในขั้นที่สามของโครงการจะมีการเพิ่มยีนที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมโครง สร้างกายภาพของใบหรือของเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับการเกิดใบแบบพืช C4 ซึ่งยีนเหล่านี้ได้มาจากการเสนอของนักวิจัยที่ร่วมโครงการ

 

 

 

พฤติกรรมของยีนจาก C4 ที่แสดงออกใน C3: การถ่ายยีนที่ได้มาจากพืช C4 ที่มีความสัมพันธ์ใกล้ชิดกับยีนในพืช C3 ทำให้ยีนสามารถแสดงออกได้ใน M หรือ BS อย่างไรก็ตาม อาจจะไม่ได้ผลที่ดีเสมอไป และการใช้ยีนจากพืชตัวให้ (donor) ที่มีความห่างกันทางวิวัฒนาการกับพืชตัวรับ (recipient) อาจทำให้ยีนที่ถ่ายเข้าไปไม่เกิดการแสดงออก นอกจากนี้การใช้ยีนทั้งชิ้น (intact gene) ซึ่งประกอบไปด้วยส่วนของ 5’UTR, introns และ 3’UTR พบว่ามีการก่อให้เกิดการแสดงออกได้ในระดับที่สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับ cDNA clone

 

 

 

ความจำเพาะของ Mesophyll Cell ในพืช C3ทั้ง promoter รวมไปถึงยีนจากพืช C4 ที่ถอดรหัสให้ PEPC, PPDK และ aspartate aminotransferase (AspAT) ได้มีการถูกถ่ายยีนเข้าไปสู่พืช C3 และนำไปสู่การสะสมในเซลล์ M โดยดูได้จากการแสดงออกของ GUS reporter ทำให้เกิดความเข้าใจเกี่ยวกับยีน PEPC ในข้าวโพดซึ่งสามารถทำงานได้เป็นอย่างดีในข้าว โดยมีการทำงานได้เกือบจะสมบูรณ์ ซึ่งบริเวณ 5’ (-1212 ถึง +78) ของยีน PEPC ในข้าวโพดก่อให้เกิดการสะสมของ GUS reporter ในข้าว japonica ได้อย่างดีและมีการแสดงออกเมื่อถูกชักนำด้วยแสง ดังนั้น cis-element จึงมีผลโดยตรงต่อการแสดงออกอย่างจำเพาะในเซลล์ M และตอบสนองต่อแสงในข้าว การวิเคราะห์ gel-rerardation พบว่า nuclei ของข้าวมีโปรตีนที่สามารถจับกับบริเวณที่เป็น cytosine rich ของ promoter จากข้าวโพด และกิจกรรมของการจับกันนี้มีความคล้ายคลึงกับ PEP-I ในข้าวโพด เมื่อยีนที่ไม่ได้ถูกดัดแปลง (ประกอบด้วย nucleotide -1212 จากจุดที่มีการถอดรหัส, intron, และ 2.5 kb downstream ของ stop codon) ได้ถูกแทนที่ในข้าว พบว่าระดับของการแสดงออกของ PEPC เกิดได้สูงและสามารถสร้างโปรตีน PEPC ที่ทำงานได้ แสดงให้เห็นว่า ยีนข้าวโพดสามารถแสดงออกอย่างสูงได้ในข้าวและมีการถอดรหัสอย่างถูกต้อง นอกจากนี้โปรตีนที่สร้างขึ้นยังสามารถทำงานได้ด้วย อย่างไรก็ตาม บริเวณที่เกิด PEPC จะอยู่ในเซลล์ M หรือไม่นั้นยังไม่มีในการรายงาน อีกหนึ่งงานวิจัย พบว่า เมื่อยีน PEPC จากข้าวโพดได้ถูกถ่ายไปสู่ข้าว indica พบว่า จะมีการสะสมของการถอดรหัสและสร้างโปรตีนอย่างมีนัยสำคัญ และทำให้อัตราการสังเคราะห์แสงค่อย ๆ เพิ่มขึ้น ณ สภาพที่มีอุณหภูมิสูงและความเข้มของแสงที่มาก ซึ่งสิ่งเหล่านี้เกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นทีละน้อยของ stomatal conductance

 

 

การถ่ายยีน PEPC ของข้าวโพดที่ไม่ได้ถูกดัดแปลงภายใต้การควบคุมของ promoter และ terminator ของมันเอง ไปยังยาสูบ (พืช C3) จะพบการสะสมของการถอดรหัสยีน ZmPEPC โดยการชักนำของแสง แต่จุดเริ่มต้นของการถอดรหัสจะเกิดขึ้นที่ก่อนถึงจุดปกติ (normal site) และเมื่อทดลองใช้ CAB promoter ของยาสูบต่อเข้ากับยีน PEPC ของข้าวโพด พบว่า จะมีการถอดรหัสที่ถูกต้องมากขึ้นและมีนัยสำคัญต่อการเพิ่มขึ้นในกิจกรรมของ PEPC นอกจากนี้ ปริมาณ malate ในใบยังมีมากขึ้นด้วย แสดงว่า กิจกรรมของเอนไซม์ malate dehydrogenase มีเพียงพอสำหรับที่จะจัดการกับการเพิ่มขึ้นของการผลิต OAA อย่างไรก็ตาม ยังไม่เป็นที่แน่ชัดว่า construct ในยาสูบจะทำให้เกิดการสะสมของ PEPC ในเซลล์เฉพาะใดบ้าง

 

 

ยีน PPDK ของข้าวโพดภายใต้การควบคุมของ promoter และ terminator ของตัวมันเองสามารถก่อให้เกิดการสะสมของโปรตีนในข้าวได้อย่างมีนัยสำคัญ และเมื่อ promoter ของยีนPPDK ในข้าวโพด (-1032 ถึง +71) ถูกต่อเข้ากับ uidA พบว่า การสะสมของ GUS จะมีความเฉพาะเจาะจงในเซลล์ Mในสภาพที่มีแสง ซึ่ง promoter ดังกล่าวสามารถผลิต GUS ได้ปริมาณที่เล็กน้อยในเซลล์ BS ได้มีการศึกษาพฤติกรรมของ promoter ของยีน PPDK orthologs ในข้าวโพดและข้าว โดยเมื่อต่อ uidA เข้ากับทั้งยีน ZmPPDK -1325 ถึง +1211 และยีน OsPPDK-1325 ถึง +211 พบว่า จะมีความสัมพันธ์กับจุดเริ่มต้นการถอดรหัสของแต่ละยีนต่อการสะสมของ GUS ในใบเมื่อชักนำด้วยแสงในข้าว japonica อย่างไรก็ตาม บริเวณ 5’ ของข้าวโพดจะชักนำให้เกิดกิจกรรมของ GUS ได้สูงกว่า และเมื่อบริเวณ 5’ ของข้าวถูกแทนที่ด้วยข้าวโพด พบว่า เกิดการสะสมของ GUS ในเนื้อเยื่อที่สังเคราะห์แสง รวมถึง M และเซลล์BS ส่วนในบริเวณ 5’ ของข้าวของยีนที่ถอดรหัส cytosolic isoform ของ AspAT จาก Panicum miliaceum จะนำไปสู่การชักนำของแสงและมีการสะสมที่เฉพาะเจาะจงในเซลล์เมโซฟิลล์

 

 

จากการศึกษาทั้งหมดนี้ แสดงให้เห็นว่า จำนวนของ promoter จากยีนของพืช C4 สามารถชักนำให้เกิดการแสดงออกใน M-specific ของข้าวได้ ซึ่ง promoter เหล่านี้ได้ถูกใช้ในการขับเคลื่อนการแสดงออกของ exogenous uidA reporter ซึ่งจะเหมือนกับ trans-factor แสดง positive หรือ negative regulator ใน M และเซลล์ BS ตามลำดับ มากกว่าที่จะเป็น posttranscriptional degradation ในเซลล์BS

 

 

 

ความจำเพาะของ Bundle Sheath Cell ในพืช C3: ความเข้าใจในหน้าที่ของโปรตีนที่ต้องการในเซลล์BSของพืช C4 สามารถนำมาใช้ในการดัดแปลงพันธุกรรมในพืช C3 โดยพื้นฐานของการศึกษา promoter ของยีนที่ถอดรหัสให้ PEPCK, NADP-ME, AspAT, SSU และ P subunit ของ glycine decarboxylase โดยบริเวณ 5’ ของยีน PCK ใน Zoysia japonica ที่ถอดรหัสได้ PEPCK (-1447 ถึง +227 ที่ประกอบด้วย 5’ UTR, exon แรก, intron แรก และบางส่วนของ exon ที่สอง) ต่อกับ uidA ก่อให้เกิดการสะสมของ GUS ในเซลล์BSของข้าวPost-translational Modifications: การศึกษาในข้าวแสดงให้เห็นว่าการปรับเปลี่ยนกระบวนการหลังการแปลรหัส (post-translational) ของโปรตีนจากข้าวโพดเกิดขึ้น แต่จะให้ผลที่ไม่สม่ำเสมอด้วยการควบคุมของ endogenous ในข้าวโพด ตัวอย่างเช่น โปรตีน PPDK ของข้าวโพดถูกควบคุมด้วยแสงสว่างและมืดในข้าว แสดงให้เห็นว่า PPDK regulatory protein ของข้าวมีปฏิกิริยากับ PPDK ของข้าวโพดอย่างเหมาะสม อย่างไรก็ตาม แม้ว่า PEPC ของข้าวโพดจะถูกควบคุมผ่านกระบวนการ photorespiration ในข้าว ซึ่งการกระตุ้นโปรตีนโดย photorespiration จะเกิดขึ้นในที่มืด ขณะที่ในข้าวโพดจะเกิดขึ้นในที่สว่าง ดังนั้นผลดังกล่าวจึงเป็นจุดวิกฤตในการที่จะถ่ายทอดลักษณะ C4 เข้าไปยังพืช C3 เพราะว่า photorespiration ของ PEPC ไม่ได้ถูกพิจารณาให้เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับอัตราการสังเคราะห์แสงที่สูงใน F. bidentis

 

 

 

ความพยายามในการเปลี่ยน Mesophyll Cells ของพืช C3 ไปเป็น Single-Cell C4:

ความ คิดดังกล่าวอยู่บนพื้นฐานของการเริ่มต้นการค้นพบที่ว่าวัฏจักร C4 ของสิ่งมีชีวิตเซลล์เดียว (single-cell) ถูกพบใน aquatic macrophytes ซึ่งพบในตระกูลของ Hydrilla และ Orcuttia การสังเคราะห์แสงแบบ C4 ของสิ่งมีชีวิตเซลล์เดียวถูกพบและศึกษาใน Suaeda aralocaspica และ Bienertia cycloptera โดยยีน PEPC จาก Cornyebacterium glutamicum, Escherichia coli, F. trinervia และ Synechococcus vulcanus ได้ถูกถ่ายไปสู่ยาสูบ และ Arabidopsis ภายใต้การควบคุมของ CaMV35S promoter ยีนเหล่านี้ได้ถูกเลือกหรือดัดแปลงให้เป็น post-translational phosphorylation ซึ่งไม่เหมือนกับกิจกรรมของเอนไซม์ที่ downregulate ทั้งยีนของ F. trinervia และ E. coli นำไปสู่การเพิ่มขึ้นสองเท่าในกิจกรรมของ PEPC เมื่อเปรียบเทียบกับ wild type ในขณะที่ยีนจาก C. glutamicum มีกิจกรรมเพิ่มขึ้นถึง 5 เท่า แม้ว่าพืชดัดแปลงพันธุกรรมเหล่านี้มีกิจกรรมของ PEPC และปริมาณ malate ในใบที่เพิ่มขึ้น แต่ยังมีการสังเคราะห์แสงและการเจริญเติบโตในอัตราที่ต่ำ การเจริญเติบโตในอัตราที่ต่ำนี้น่าจะมีสาเหตุมาจากการเพิ่มขึ้นของการหายใจ ที่ผลิต OAA หรือ malate ภายในวัฏจักร TCA อีกหนึ่งงานวิจัย เมื่อยีน PEPC จากมันฝรั่งถูกดัดแปลงให้ลดผลกระทบอันเนื่องจากการยับยั้งโดย malate พบว่า flux จาก ¹⁴CO₂ หลังจากใส่เข้าไปยัง malate จะมีปริมาณที่มากขึ้นและมีกิจกรรมที่มีสหสัมพันธ์กับจำนวนโปรตีน PEPC อย่างไรก็ตาม การแสดงออกที่เกี่ยวข้องนำไปสู่การลดการเจริญเติบโตและผลผลิตของหัวมัน ฝรั่ง เนื่องจากคาร์บอนจะถูกจับโดย PEPC ทำให้เกิดกรดอินทรีย์และกรดอะมิโนที่ใช้หายใจในวัฏจักร TCA

การศึกษา PEPC จาก S. vulcanus พบว่า มีความเข้มข้น (intensitive) ต่อ feedback inhibition ณ pH ตามธรรมชาติ และพบว่าน่าจะมีส่วนในการหลีกเลี่ยงกิจกรรมการยับยั้ง allosteric ภายใต้การควบคุมของ CaMV35S promoter การวิจัยใน Arabidopsis พบว่า การเพิ่มขึ้นของ PEPC จะทำให้เกิดใบซีดหรือยับยั้งการพัฒนาของใบและปรากฏเป็นช่องทางของ carbohydrate skeleton จากการสังเคราะห์ aromatic amino acid ไปใน glutamine, asparagines และ arginine ซึ่งเกี่ยวข้องกับวัฏจักร TCA

 

 

ความพยายามในการทำให้เกิดการเพิ่มพูนของ NADP-ME ในข้าว ได้มีการทดลองใช้ CAB promoter ของข้าวในการขับเคลื่อน cDNA ที่ถอดรหัสให้ NADP-ME จากข้าวโพดและข้าว พบว่า ยีนจากข้าวโพดทำให้มีกิจกรรมเพิ่มขึ้น 20 ถึง 70 เท่าเมื่อเปรียบเทียบกับตัวควบคุม (control) ในขณะที่ยีนจากข้าวทำให้เกิดการยับยั้งร่วมกัน จากการวิเคราะห์ immunochemistry แสดงให้เห็นว่า สายพันธุ์ที่ได้รับยีนจากข้าวโพดนั้น NADP-ME จะพบใน chloroplast นอกจากนี้ปริมาณคลอโรฟิลล์และกิจกรรมของ PSII มีสหสัมพันธ์ทางลบกับกิจกรรมของ NADP-ME การเปลี่ยนแปลง redox ใน BS chloroplast เกิดเนื่องจากอัตราการเพิ่มขึ้นของ decarboxylation ใน BS chloroplast ที่อาจจะไปเปลี่ยนแปลงปริมาณคลอโรฟิลด์และชั้นของ thylakoids ซึ่งพบใน NADP-ME type species

การศึกษาโดยใช้เอนไซม์ decarboxylase ที่แตกต่างกัน ถูกใช้ในการสร้าง (build up) วัฏจักร C4 ให้สมบูรณ์ขึ้นใน mesophyll ของพืช C3 ระบบที่ง่ายคือการทำให้พืชมี PEPC ใน cytosol และมี PEPCK (normal cytolic) และ PPDK ใน chloroplast การศึกษา stacking transgene มีพื้นฐานจากการทำซ้ำของ biochemistry associated ด้วย subtype ของ NADP-ME ในเซลล์เมโซฟิลล์ของข้าว เริ่มต้นจาก cDNA ที่ถอดรหัส PEPCK จาก Urochloa panicoides ถูกถ่ายเข้าไปสู่ข้าวและมีเป้าหมายที่ chloroplast โดยใช้ SSU transit peptide พบว่า ต้นข้าวเหล่านี้มีกิจกรรมของ PEPCK ที่สูงและเป็นที่น่าแปลกใจ เมื่อ ¹⁴CO₂ ได้ถูกส่งไปยังใบ มากกว่า 20% ของ radio label และถูกรวบรวมไปยัง four-carbon compound เมื่อเปรียบเทียบกับ wild type ซึ่งเกิดขึ้น <1% แสดงให้เห็นว่า PEPCK ที่อยู่ใน chloroplast ทำให้เกิดวัฏจักร C4 ขึ้นบางส่วนในเซลล์เมโซฟิลล์ของข้าว อย่างไรก็ตาม การเปลี่ยนแปลงชีวเคมีที่แท้จริงของการเกิด phenotype ดังกล่าวนี้ยังไม่เป็นที่แน่ชัด งานวิจัยลำดับต่อมา ได้แก่ การนำสายพันธุ์ PEPCK ผสมกับสายพันธุ์ overexpression ของยีน ZmPEPC แต่ผลการทดลองพบว่า ต้นข้าวมีการเจริญเติบโตที่ไม่สูง และ thylaoid เกิดการขยายและการสะสมของคลอโรฟิลล์มีต่ำกว่าตัวควบคุม

การศึกษาชีวเคมีที่เกี่ยวข้องกับ NADP-ME subtype ในเซลล์เมโซฟิลล์ของข้าว โดยสายพันธุ์ที่มี PEPC และ PPDK ปริมาณสูงถูกผสมพันธุ์กัน จากนั้น cDNA สำหรับการสร้างเอนไซม์ malate dehydrogenase และ NADP-ME ได้ถูกเพิ่มเข้าไป พบว่า สายพันธุ์ single transgenes มีอัตราของการสังเคราะห์แสงที่เปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อยและมีนัยสำคัญต่อ phenotype คือ เกิดลักษณะต้น stuning และ chlorosis ซึ่งเกี่ยวข้องกับ overexpression ของ NADP-ME โดยข้าวดัดแปลงพันธุกรรมมีการเปลี่ยนแปลงอัตราการสังเคราะห์แสงที่ไม่มาก และไม่มีพบว่ามีความเข้มข้นของ CO₂ รอบ ๆ RuBisCO

 

 

 

3.2. การปรับปรุงพันธุ์เพื่อลดสภาวะ photoinhibition

แสงแดดจัดชักนำให้เกิดกระบวนการยับยั้งด้วยแสงของการสังเคราะห์แสงและอาจรวมถึงความเสียหายอันเนื่องมาจากแสง (photodamage) ขององค์ประกอบที่ใช้ในการสังเคราะห์แสงเมื่อกระบวนการตรึงและใช้คาร์บอน (carbon assimilation) ได้รับผลกระทบจากการเปลี่ยนแปลงอย่างรุนแรงของสิ่งแวดล้อม เช่น ความแห้งแล้ง และการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิอย่างรุนแรง (Xu, 2001) Horton และ Ruban (1992) ได้เสนอความเชื่อว่าอัตราการสังเคราะห์แสงที่เกิดขึ้นในสภาพแปลงปลูกนั้นไม่เคยถึงระดับของอัตราการสังเคราะห์แสงสูงสุดได้ตลอดเวลา (intrinsic maximum photosynthesis rate) ในช่วงเวลาของวันและช่วงเวลาตลอดฤดูการเพาะปลูก การสังเคราะห์แสงเกิดขึ้นได้ถึงระดับสูงสุดได้เพียงระยะเวลาสั้น ๆ เท่านั้น ปัจจัยภายในเช่นปฏิริยาการยับยั้งโดยการสะท้อนกลับ (feedback inhibition) หรือความจำกัดของแหล่งรับ (sink limitation) และปัจจัยภายนอกเช่น oxidative stresses หรือ การยับยั้งด้วยแสง (photoinhibition) ก็สามารถจำกัดศักยภาพของการสังเคราะห์แสงไม่ให้เกิดได้เต็มประสิทธิภาพ มีการการศึกษาเบื้องต้นบางอย่างบ่งชี้ว่า ช่องทางการกำจัดอิเล็คตรอนโดยการส่งถ่ายอิเล็คตรอนบางช่องทาง เช่นผ่านทาง xanthophyll cycle และการกำจัดอนุมูลอิสระโดยเอนไซม์เช่น superoxide dismutase, catalase และ ascorbate peroxide สามารถทำให้พืชทนทานต่อ photo-oxidative stresses ได้ ความสามารถในการปกป้องความเสียหายจากแสง (photoprotection) มีความผันแปรระหว่างชนิด (species) ของพืช (Johnson et al., 1993) Tu และคณะ (1995) รายงานถึงความแปรปรวนทางพันธุกรรมที่เกี่ยวกับการยับยั้งด้วยแสงและการยับยั้งการสังเคราะห์แสงในช่วงเที่ยงวันภายใต้สภาวะที่ถูกเหนี่ยวนำด้วยแสง สิ่งนี้สามารถนำมาพิจารณาได้ถึงขอบเขตของการพัฒนาด้วยการปรับปรุงพันธุ์

 

 

 

จากรายงานของ Horton (2000) พบว่าความเสียหายจากแสง (Photodamage) นั้นไม่ถูกตรวจพบในแปลงปลูกข้าวทดลองที่มีระบบชลประทาน และนอกจากนี้ยังมีกลุ่มนักวิจัยอื่นที่รายงานว่า ใบแก่และใบที่ขาดธาตุไนโตรเจนนั้นจะอ่อนแอต่อ Photoinhibition เมื่ออยู่ในสภาพที่ได้รับรังสีจากดวงอาทิตย์รุนแรง (Murchie et al., 1999; Chen et al., 2003) นอกจากนี้ Murchie et al. (1999) ได้รายงานว่าในใบข้าวที่ชูใบตั้งตรงสามารถลดระดับการรับรังสีจากดวงอาทิตย์ของพื้นที่ใบในช่วงเวลาที่มีการส่งรังสีจากดวงอาทิตย์ที่รุนแรงได้ ดังนั้นใบที่ตั้งตรงจึงสามารถลดการเกิด Photoinhibition ได้ดีกว่าใบที่วางตัวอยู่ในแนวนอน

 

 

 

ได้มีการเปรียบเทียบความแตกต่างระหว่างพันธุ์ข้าวที่ทนทานต่อphotooxidation(photoinhibition) ได้ดี คือ Wuyugeng3(ทนทาน)และ Xiangxian(ไม่ทนทาน) ได้พบความแตกต่างที่สำคัญคือ พันธุ์ข้าวที่มีความทนต่อphotooxidation มีค่าFv/Fm(photochemical efficiency) ที่สูงกว่า มีการแสดงออกของ super oxide dismustase สูงกว่า, มี oxidative oxygen species ต่ำกว่า มีturnover ของPSII-D1 protein ต่ำกว่า และมีการลดลงของ Net photosynthesis ที่น้อยกว่า พันธุ์ข้าวที่ไม่ทนทานต่อ photooxidative stress(Xiangxian) และเมื่อคัดเลือกจากข้าวจำนวน44สายพันธุ์ ในสภาวะแปลงที่เกิด photooxidation และ shading ยังสามารถแบ่งข้าวออกได้4กลุ่ม คือ กลุ่มทนต่อphotooxidation-ทนต่อ shading, กลุ่มทนต่อphotooxidation-ไม่ทนต่อshading, กลุ่มไม่ทนต่อphotooxidation-ทนต่อshading และกลุ่มไม่ทนต่อทั้งphotooxidation-shading(Demao and Xia, 2001) และยังพบว่า พันธุ์ข้าวที่ทนทานต่อสภาพ oxidative stress ยังมี chlorophyll content ที่ลดลงน้อยกว่าพันธุ์ไม่ทนทาน มีกิจกรรมของ oxygen radical scavenging enzyme เช่น SOD ที่สูงกว่ากลุ่มพันธุ์ที่ไม่ทนอย่างชัดเจน อีกทั้งการแสดงออกของXanthophyll cycle ที่ชัดเจน เพื่อกระจาย quantum energy ที่ตกกระทบสู่ PSII ให้ลดผลกระทบกับการทำงานของPSIIน้อยที่สุด(Xu et al.,2000) พันธุ์ข้าวที่สามารถทนทานต่อphotooxidation ทั้งในสภาพที่มีแสงจัดและแสงต่ำ(shading) สามารถรักษากิจกรรมของPSIIและRuBISCO เอาไว้ได้ในทุกสภาพของ oxidative stress

 

 

 

 

3.3. การปรับปรุงพันธุ์เพื่อลดสภาวะ photorespiration

 

ความเข้มข้นของปริมาณ CO2 ในบรรยากาศที่มีเพิ่มขึ้นจากประมาณ 270 µL L-1 ในช่วงก่อนการเกิดอุตสาหกรรม ไปเป็นมากกว่า 380 µL L-1 ในปัจจุบัน และยังขึ้นอยู่กับกิจกรรมของมนุษย์ซึ่งสามารถทำให้ปริมาณ CO2 เพิ่มขึ้นได้ถึง 530-970 µL L-1 ในสิ้นศตวรรษนี้ ในขณะที่ความเข้มข้นของปริมาณ O2 ในบรรยากาศลดลงอย่างน่าวิตก โดยเฉลี่ยของปริมาณ O2 ที่ลดลง 1.4 µL L-1 ต่อ µL L-1 CO2 เนื่องจากมีการเผาไหม้จากการใช้น้ำมันเชื้อเพลิงในสัดส่วนที่สูงจึงทำให้ปริมาณ CO2 ที่ถูกปลดปล่อยออกมามากกว่าที่ปริมาณ O2 ในบรรยากาศ อย่างไรก็ตาม ระดับของปริมาณ O2 ในปัจจุบันอยู่ที่ประมาณ 209 µL L-1และการเปลี่ยนความเข้มข้นของปริมาณ O2 เกิดขึ้นในสัดส่วนที่น้อยกว่าปริมาณ CO2 นอกจากนี้อุณหภูมิเฉลี่ยของโลกได้สูงขึ้น 0.76 °C จากเมื่อ 150 ปีก่อนและมีแนวโน้มที่จะเพิ่มสูงขึ้นอยู่ในช่วงระหว่าง 1.7-3.9 °C ในศตวรรษนี้ ดังนั้นการเปลี่ยนแปลงของก๊าซและอุณหภูมิของบรรยากาศโลกจึงมีผลโดยตรงต่อความสมดุลระหว่างการตรึงคาร์บอน และลดกระบวนการเกิด photorespiration โดยตรงซึ่งจะส่งผลดีในพืช C3 ในพืช C4 ซึ่งมี metabolism สำหรับปรับตัวเมื่อมีการเพิ่มขึ้นของปริมาณ CO2 ดีอยู่แล้ว ซึ่งผลลัพธ์ของการเพิ่มขึ้นของปริมาณ CO2 ในบรรยากาศจึงมีผลกระทบต่อการเจริญเติบโตน้อยกว่าพืช C3 ได้มีการให้ความเห็นไว้ว่า การเพิ่มขึ้นของปริมาณ CO2 นี้จะเปลี่ยนแปลงการกระจายตัวทางภูมิศาสตร์ของพืช C3 และ C4 เนื่องจากเกิดผลกระทบของความแตกต่างของแต่ละกลไกของการตรึงคาร์บอน การเพิ่มขึ้นของปริมาณ CO2 ในบรรยากาศในอนาคตถูกคาดคะเนว่าจะเป็นประโยชน์ที่ดีต่อพืช C4 ในการสังเคราะห์แสงมากกว่าในพืช C3 แต่ยังคงมีความไม่แน่นอนที่จะต้องพิจารณาถึงปริมาณปริมาณ CO2 ที่สูงในบรรยากาศนั้นที่มีผลต่อการแข่งขันกันของพืช C3 และ C4 หรือไม่ ส่วนอุณหภูมิที่สูงขึ้นนั้นจะเป็นผลดีต่อการสังเคราะห์แสงของพืช C4 อีกด้วย นอกจากนี้ศักยภาพของข้อจำกัดของไนโตรเจนในสภาพแวดล้อมยังไม่เป็นปัญหาสำหรับพืช C4 เช่น อ้อย และพืช Miscanthus gigantus ซึ่งถูกพิจารณาให้ใช้เป็นพืชพลังงาน โดยพืชเหล่านี้อาจจะเกิด house endogenous N-fixing symbiont (แบบพึ่งพาอาศัยกัน) ซึ่งจะทำให้มีผลกระทบต่อไนโตรเจนในดินไม่มากนัก

 

 

 

การปรับตัวให้เข้ากับสภาพแวดล้อมต่อปริมาณ CO2-dependent ที่เพิ่มขึ้นนั้น การสังเคราะห์แสงอาจจะมีประสิทธิภาพที่ลดลงในบางกรณีของพืช C4 เมื่อวัฏจักรคัลวินมีกิจกรรมภายใต้สภาพแวดล้อมที่มีปริมาณ CO2 ที่สูง จากการตรวจเอกสาร พบว่า พืช C4 แต่ละชนิด เช่น Amaranthus retroflexus, ข้าวโพด, ข้าวฟ่าง และ Paspalum dilatatum สามารถได้ประโยชน์จากการเพิ่มขึ้นของปริมาณ CO2 ในบรรยากาศและทำให้มีอัตราการสังเคราะห์แสงและการสะสมคาร์บอนที่เพิ่มขึ้นด้วย อย่างไรก็ตาม ระดับของการตอบสนองต่อการสังเคราะห์แสงต่อปริมาณ CO2 ที่สูงนั้นจะมีความผันแปรระหว่างชนิดพืชและสภาพแวดล้อม นอกจากนี้พืช C4 จะแสดงโครงสร้างของใบที่เปลี่ยนไปเมื่อพืชนั้นเจริญเติบโตในสภาพที่มีปริมาณ CO2 สูง การเปลี่ยนแปลงนี้เกี่ยวข้องกับการลดลงของโปรตีนในใบและในคลอโรฟิลด์ ซึ่งเป็นผลทำให้ความเหนียวของเซลล์BS และความหนาแน่นและแบบแผนของปากใบ (stomatal )เปลี่ยนไป ยกตัวอย่างเช่น stomatal index (ได้แก่ สัดส่วนของเซลล์ epidermal ที่อยู่ใน stomata) เพิ่มขึ้นในการตอบสนองต่อปริมาณ CO2 ในพืชใบเลี้ยงเดี่ยวที่เป็น C4 สองชนิด ได้แก่ ข้าวโพดและ P. dilatatum ผลของโครงสร้างใบที่เปลี่ยนแปลงนี้ไม่สามารถอธิบายความสัมพันธ์กับการสังเคราะห์แสงได้ดังเช่นในพืช C4 เมื่อการสะสมของอัตรา CO2 ยังไม่เปลี่ยนแปลงมาก

 

 

 

CO2-signaling pathway มีอิทธิพลต่อโครงสร้างใบและส่วนประกอบภายในใบที่ยังมีการศึกษากันน้อยมาก แต่ CO2 signal เป็นกลไกที่เคลื่อนย้ายจากใบแก่ไปยังใบที่กำลังพัฒนา CO2-signaling pathway เป็นกระบวนการสำคัญต่อการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างภายในใบและองค์ประกอบที่อาจจะสัมพันธ์ต่อการเปลี่ยนแปลงของอัตราของการเกิด photorespiration เหมือนกับการสังเคราะห์แสง โดยเฉพาะอย่างยิ่งในพืช C4 ที่อยู่ภายใต้สภาพที่มีปริมาณ CO2 ที่เข้มข้นและการดำเนินการของ photorespiration ที่ประมาณ 2-5% ต่อ CO2 fixation สุทธิ ปัจจัยที่มีผลกับกิจกรรมของ CAT oxidation load ในรูปแบบของการผลิต H2O2 ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์แสงและการเกิด photorespiration จะลดลงในเนื้อเยื่อที่มีการสังเคราะห์แสง เมื่อ CO2 availability เพิ่มขึ้น ถึงแม้ว่าการเกิด photorespiration จะเป็นแหล่ง metabolic ที่สำคัญสำหรับการสร้าง H2O2 ซึ่งในใบของพืช C4 จะมีปริมาณน้อยกว่าในพืช C3 แต่อาจจะถูกยับยั้งได้ในพืชที่เติบโตในสภาพที่มี CO2 สูง นอกจากนี้ ความเหนียวที่ลดลงของBSในสภาพ CO2 สูง อาจจะเป็นทางเลือกหนึ่งที่ทำให้เกิดการแลกเปลี่ยนก๊าซและมีผลต่อ flux ของ metabolite ของกระบวนการ photorespiration เนื่องจากว่า H2O2 เป็น signaling molecule ที่มีประสิทธิภาพสูงจึงที่มีหน้าที่ต่อการเจริญเติบโต และมีความเป็นไปได้ว่า การผลิต altered flux photorespiration H2O2 และ destruction จะมีส่วนร่วมใน signaling network ซึ่งจัดการการปรับตัวต่อสภาพแวดล้อมของการเจริญเติบโตของพืช C3 และพืช C4 ในสภาพ CO2 สูง

 

 

ต้นกลายพันธุ์ที่ใช้ศึกษา photorespiration (Photorespiration mutants)

การคัดแยกต้นกลายพันธุ์ที่มีผลต่อกระบวนการ photorespiration จะทำให้ทราบถึงการแสดงออกของ phenotype ของพืชที่จะเจริญเติบโตอยู่ได้ในสภาพอากาศปัจจุบันที่มีปริมาณ O2 อยู่ประมาณ 21% และมี CO2 อยู่ประมาณ 385 µL ซึ่งจะสามารถเจริญเติบโตได้ในสภาพที่ไม่มีการเกิด photorespiration ด้วย เช่น ในบรรยากาศที่จะมีปริมาณ CO2 สูงขึ้นในอนาคต การเข้าถึง phenotype ที่ทำให้ได้ลักษณะดังกล่าวได้ประสบความสำเร็จในพืช C3 บางชนิด โดยที่ชัดเจนที่สุดคือ Arabidopsis และ ข้าวบาร์เลย์ ซึ่งได้มีการจำแนกต้นกลายพันธุ์ไว้เป็นจำนวนมาก แต่ความสำเร็จอย่างสมบูรณ์แบบนั้นยังไม่มีรายงานในพืชชนิดใดเลย ตัวอย่างเช่น ยังไม่มีรายงาน พืชกลายพันธุ์ต่อ glycolate oxidase (GO) ที่เกี่ยวข้องกับลักษณะ phenotype ของการเกิด photorespiration เลยในพืช C3 อย่างไรก็ตาม เป็นที่น่าสนใจยิ่งว่า phenotype ของการเกิด photorespiration ได้ถูกรายงานไว้ในข้าวโพดกลายพันธุ์แบบ homozygous ที่มีการหยุดการทำงานของอัลลีล GO1 โดยวิธี transposon

 

 

 

การจำแนกเอนไซม์ที่มีผลกระทบต่อการแบ่งกลุ่มกลายพันธุ์ของกระบวนการ photorespiration มีความจำเป็นเพื่อที่จะสามารถเปรียบเทียบการเกิด flux และ metabolite กับต้นดั้งเดิม (wild type) ได้ แต่ในหลาย ๆ กรณีได้ให้ความสำคัญกับผลกระทบที่เกิดขึ้นจริงกับยีนที่ศึกษา ตัวอย่างเช่น ต้นกลายพันธุ์ของ Arabidopsis ที่มีการสะสม glycine อย่างมากหลังจากการเคลื่อนย้ายต้นดังกล่าวจากบริเวณที่มีปริมาณ CO2 ที่สูงไปสู่อากาศปกติ ซึ่งอาจจะไม่มีผลกระทบต่อ glycine decarboxylase (GDC) ทั้งสี่subunits ส่วนการ knockout ยีนในยาสูบ จะช่วยในการอธิบายและยืนยันการทำงานของยีนที่ศึกษาได้ ตัวอย่างเช่น การเจริญเติบโตของยาสูบในสภาพที่มีปริมาณ CO2 สูงด้วยสายพันธุ์ยาสูบ antisense ของ GO, Ferredoxin-glutamate synthease (Fd-GAGAT) หรือ dicarboxylate transporter (DIT)

 

 

การศึกษาการผลิต chloroplastic glycolate และ การเปลี่ยนกลับไปเป็น glycine ใน peroxisome

ในขั้นตอนแรกที่ 2-PG ถูก dephosphorylated ใน chloroplast ผ่าน 2-phosphoglycolate phosphatase (PGLP) และ glycolate จะถูกผลิตขึ้นและส่งผ่านไปยัง peroxisomes สำหรับกระบวนการ metabolization ในขั้นต่อไป (ภาพที่ 1) จากการศึกษาใน Arabidopsis พบยีน 2 ยีน ที่แปลรหัสให้ PGLPs ทำงาน แต่เฉพาะยีนPGLP1 (At5g36700) เท่านั้นที่มีส่วนร่วมในกระบวนการ photorespiration การศึกษาต้นกลายพันธุ์ของยีนดังกล่าว พบว่า มีกิจกรรมของ PGLP ต่ำมากในใบ และไม่สามารถอยู่รอดได้ในสภาวะอากาศปกติ แต่จะสามารถเจริญเติบโตได้ดีในสภาพที่มีปริมาณ CO₂ ที่สูง และมี photorespiration ที่ต่ำ

 

ใน peroxisomes glycolate oxidase (GO) จะเร่งปฏิกริยา oxidation ของ glycolate ในจำนวนโมลาร์ที่เท่ากันกับ glyoxylate และ H₂O₂ Catalase (CAT) จะเปลี่ยน H₂O₂ และ glutamate:glyoxylate aminotransferase (GGAT) เปลี่ยนรูป glyoxylate ไปเป็น glycine ซึ่งจะส่งผ่านไปยัง mitochondria (ภาพที่ 1) โดยการยับยั้ง GO ในข้าว พบว่าจะทำให้ต้นข้าวตายในสภาพที่มี CO₂ สูง นอกจากนี้ ยังพบว่า GO มีหน้าที่สำคัญในการควบคุมการสังเคราะห์แสง ซึ่งมีความเป็นไปได้ในการยับยั้งปฏิกิริยาย้อนกลับ (feedback) ของเอนไซม์ RubisCO activase

 

 

การศึกษาการเปลี่ยน glycine ไปเป็น serine ใน mitochondrial

ใน mitochondria glycine จะถูกขจัดเอาส่วนที่เป็น carboxyl (decarboxylated) และ กลุ่มอะมิโน (deaminated) ออกไป โดยใช้ glycine decarboxylase complex (GDC) ทำให้ได้ CO₂, NH₄⁺ NADH และ 5,10-methylene tetrahydrofolate หลังจากนั้น serine hydroxymethyl transferase (SHMT) จะนำไปใช้เพื่อการสังเคราะห์ serine โดยการส่งผ่าน activated C1 unit บนโมเลกุลอื่นของ glycine (ภาพที่ 1 ด้านบน)

 

GDC เป็น hetero-tetramer ประกอบด้วยโปรตีน P, L, H และ T ใน Arabidopsis พบสองยีนที่เกี่ยวข้องกับโปรตีน P (At4g33010 และ At2g26080) และโปรตีน L (At3g17240 และ At1g48030) และพบ 3 ยีน ที่เกี่ยวข้องกับโปรตีน H (At2g35370, At2g35120 และ At1g32470) และ 1 ยีนสำหรับโปรตีน T (At1g11860) อย่างไรก็ตาม ยังมีการศึกษายีนเหล่านี้ จาก T-DNA-tagged mutant อยู่อย่างจำกัด การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้ แสดงให้เห็นว่า การ knockout ทีละยีนที่เกี่ยวข้องกับโปรตีน P พืชกลายพันธุ์จะมีการเจริญเติบโตที่ปกติ ในทางตรงข้าม การ knockout 2 ยีนพร้อมกัน จะทำให้ต้นพืชตายในสภาพที่ไม่มีการเกิด photorespiration จึงมีสมมุติฐานว่า การเกิด GDC ไม่สามารถจะทำการ bypass ได้ ดังนั้น GDC จึงน่าจะมีความจำเป็นอย่างยิ่งอย่างน้อยสำหรับ 1 คาร์บอนเมตาบอลิซึม (ภาพที่ 7) โดยการรีไซเคิล glycine ที่เป็นตัวตั้งต้นจาก extramitochondrial SHMT ซึ่งในต้น Arabidopsis พบยีน At4g37930 ที่เกี่ยวข้องการ photorespiration SHMT1 ซึ่งต้นกลายพันธุ์ของยีนดังกล่าวจะตายในสภาวะที่มี ambient CO₂ แต่จะเจริญเติบโตได้ปกติในสภาพวะที่มี CO₂ สูง

ในส่วนของปฏิกิริยา GDC นั้น 1 ใน 4 ของพันธะคาร์บอนจะสูญเสียไปเป็น CO₂ และจะปลดปล่อย NH₄⁺ ในจำนวนโมลาร์ที่เท่ากัน ซึ่งจำเป็นต่อการ re-assimilation ผ่านวัฏจักรของ glutamine synthetase (GS)/ferredoxin-dependent glutamate:oxoglutarate amino transferase (Fd-GOGAT) ในประเด็นดังกล่าวของ nitrogen re-assimilation pathway ได้ถูกยืนยันผลโดยการศึกษาต้นกลายพันธุ์ของ Fg-GOGAT (At5g04140) ซึ่งแสดง typical photorespiratory phenotype

 

 

การปรับปรุง photorespiration และ การเจริญเติบโตของพืช

ในทางทฤษฎี การลดการเกิด photorespiration น่าจะเพิ่มการอัตราตรึง CO₂ เพื่อทำให้พืชมีการเจริญเติบโตที่ดี อย่างไรก็ตาม จากการวิจารณ์งานวิจัยที่ได้กล่าวมาข้างต้นนั้น การขัดขวางการเกิด photorespiration ในพืชกลายพันธุ์จะทำให้การเจริญเติบโตลดลงหรือตายได้ ดังนั้น ทางเลือกอีกทางหนึ่งคือ ทฤษฎี bypass โดยการหลีกเลี่ยงการสร้าง phosphoglycolate บางประเภทโดย RubisCO ในเส้นทางที่เลือกได้ Kebeish et al. อธิบายการใส่ bacteria glycolate oxidation pathway เข้าไปใน chloroplast ของต้น Arabidopsis ซึ่งจะเปลี่ยน glycolate ใน 3 ขั้นตอน ไปเป็น glycerate และจะทำให้เกิดการ bypass ไม่ให้เกิด photorespiration ได้ เส้นทางนี้ประกอบด้วย การปลดปล่อย CO₂ ที่คล้ายกับขั้นตอนของ C2 pathway แต่ผู้เขียนได้ตั้งสมมุติฐานว่า การเปลี่ยนแปลงการปลดปล่อย CO₂ จาก mitochondrium ไปเป็น chloroplast จะมีความเข้มข้นของ CO₂ เพิ่มขึ้นรอบ ๆ RubisCO และมีผลทำให้กิจกรรมของ RubisCO oxygenase ลดลงใน in vivo นอกจากนี้ พลังงานและ reducing equivalents อาจจะรักษาไว้ได้ในการ bypass แต่มันจะไม่รวมถึงการปลดปล่อยและการตรึงใหม่ (refixation) ของแอมโมเนีย นอกจากนี้พลังงานจาก glycolate oxidation จะถูกเก็บไว้ใน reducing equivalents และไม่เผาผลาญโดยการสร้าง H₂O₂ ด้วยเหตุนี้ พืชที่ดัดแปลงพันธุกรรม (transgenic lines) จะสามารถเพิ่มน้ำหนักรวมในส่วนของยอดและรากได้ อย่างไรก็ตามยังคงที่จะต้องมีการวิเคราะห์ถึงเรื่องผลประโยชน์ที่จะได้รับตามทฤษฎีของการ bypass ของความเป็นไปได้ของการเพิ่มการเจริญเติบโต เงื่อนงำของคำถามดังกล่าวบางทีอาจจะได้มาจากทางเลือกของ glycolate ที่มีการ oxidize ที่สมบูรณ์จนได้ CO₂ ใน chloroplast ซึ่งใช้เพียง 2 enzymatic steps (H Fahnenstich, PhD thesis, University of Cologne, 2008) การที่จะประสบความสำเร็จจะต้องมีทั้ง การได้ความเข้มข้นของปริมาณ CO2 ที่สูงใน chloroplast และการป้องกันการปลดปล่อยแอมโมเนียที่ได้จากการ bypass กระบวนการ photorespiration เพราะว่า จะมีผลกระทบทางบวกต่อการเจริญเติบโต สิ่งที่น่าสนใจยิ่ง คือ การสังเคราะห์ทางอ้อมทั้งคู่นั้นจาก photorespiration จะทำให้นึกถึงเส้นทางที่สองของการเกิด photorespiration ซึ่งเกิดขึ้นตามธรรมชาติใน Synechocysis มันเป็นสิ่งที่น่าสนใจยิ่งเพื่อที่จะทำความเข้าใจว่า ทำไมเส้นทางนี้จึงได้หายไปในพืชชั้นสูง ดังนั้นถ้าการสังเคราะห์แสงโดยวิธี re-engineering ประสบความสำเร็จในการทำให้ความสามารถในการสังเคราะห์แสงในต้น Arabidosis ดีขึ้น เหตุผลหนึ่งอาจจะเป็นเพราะวิวัฒนาการของใบที่มีลักษณะเฉพาะ (specific leaf architechtures) ในแต่ละสปีชีส์ที่แตกต่างกัน ตัวอย่างเช่น ข้าวจะมีการปรับตัวต่อ maximize the scavenging ของ photorespired CO₂ และต่อการเพิ่มขึ้นของ diffusive conductance ของ CO₂ ดังนั้นจึงพิจารณาได้ว่า โครงสร้างที่เห็นได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์ (ultrastructure) น่าจะมีประโยชน์ไม่มากจาก glycolate oxidation ใน chloroplast ของข้าว

 

 

กระบวนการเสริมสำหรับ photorespiration (Accessory Pathways)

การจำแนกกระบวนการเสริมจะช่วยเพิ่มเติมข้อมูลดการศึกษากระบวนการ photorespiration ให้สมบูรณ์ยิ่งขึ้น ได้แก่ การศึกษาเส้นทาง metabolite ของ photorespiration พบว่าจะไม่สมบูรณ์ ณ ที่จุดที่ดีที่สุด เนื่องจาก Arabidopsis GS2 เป็นเป้าหมายต่อ chloroplast และ mitochondria ซึ่งกระบวนการทางเลือกของmitochondria ของ ammonia reassimilation ได้มีการเสนอแนะว่าสามารถเกิด chloroplastic GS/GOGAT pathway ได้อย่างสมบูรณ์ เช่นเดียวกับ dual peroxisomal/cytosolic location ของ hydroxypyruvate reduction Pathway นอกจากนี้กระบวนการเสริมยังคงพบใน metabolism ของ glycolate และ glyoxylate โดย metabolite ของ glycolate ที่พบใน cyanobacteria จะมีกิจกรรมผ่านทาง dehydrogenase (GLYDH) มากกว่าทาง GO และกิจกรรมดังกล่าวได้ถูกพบในทั้งสาหร่ายและพืชที่มีคลอโรพลาสต์ ส่วนสาหร่ายที่เป็น unicellular ที่ขาด peroxysomes จะมี mitochondrial GLYDH ในการศึกษาพันธุ์กลายของ Chlamydomonas ที่ขาด GLYDH จะมีต้องการปริมาณ CO₂ ที่มากขึ้นสำหรับการเจริญเติบโต

 

 

 

งานวิจัยที่แสดงให้เห็นว่า เส้นทางเลือกของการเกิด glycolate oxidation ไม่ได้ถูกจำกัดอยู่เฉพาะในแบคทีเรียและสาหร่ายเท่านั้น โดยพบว่า ยีนของ Arabidopsis ที่แปลรหัสต่อ mitochondrial GLYDH ได้ถูกรายงานการศึกษา และยีน homologous ยังถูกพบในข้าวด้วย ต้นกลายพันธุ์ของ Arabidopsis ที่ยับยั้งการทำงานของยีนดังกล่าวนี้ไม่ได้เปลี่ยนแปลง phenotype ของกระบวนการ photorespiration แต่ได้มีการศึกษาในหลาย ๆ งานวิจัยที่พบว่า มีเอนไซม์ที่ให้ความช่วยเหลือ metabolism ของ photorespiratory glycolate โดยรูปแบบการแสดงออกของยีนนี้ได้ถูกจัดไว้อยู่ในกลุ่มที่ 2 (ภาพที่ 8 ดูที่ด้านบน) การเริ่มต้นการทำงานของเอนไซม์นี้ระหว่างการเกิด photorespiration จะสามารถคาดคะเนการเพิ่มขึ้นของความต้องการต่อ mitochondrial respiratory electron transport (RET) ผ่านความสามารถของเอนไซม์ที่มีในปริมาณไม่มากเมื่อเปรียบเทียบกับ GDC Glyoxylate อื่น ๆ ที่ผลิตขึ้นใน mitochondria และน่าที่จะเปลี่ยนกลับไปเป็น glycine จำนวน 1 ใน 3 ของ annotated alanine-dependent amino transferase โดยสรุปแล้วต้นกลายพันธุ์ที่ยับยั้งเอนไซม์เหล่านี้จะไม่ได้ทำให้ phenotype ของการเกิด photorespiration เปลี่ยน และยีน AGT3 ยังไม่ได้มีการแสดงออกที่สูงในเนื้อเยื่อที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์แสงอีกด้วย (ภาพที่ 8 ดูที่ด้านบน)

 

ความสัมพันธ์ของ GO และ GLYDH ต่อการเกิด photorespiratory glycolate oxidation ยังไม่สามารถอธิบายได้อย่างชัดเจน ส่วนการศึกษา phenotype ของการเกิด photorespiration ในยีนกลายพันธุ์ cat2 พบว่า มีกิจกรรมของ catalase (CAT) น้อยกว่า 20% เมื่อเทียบกับต้น wild type ดังนั้นจึงสามารถสรุปได้ว่า H₂O₂ จำนวนหนึ่งหรือมากกว่าที่ใช้สร้าง GO จะมีความสำคัญต่อการเกิด metabolism ของการเกิด photorespiration นอกจากนี้การศึกษา phenotype ของยีน cat2 เกี่ยวข้องกับการรบกวนสถานะของ cell redox นั้นได้ถูกกล่าวไว้แล้วในการศึกษาต้นกลายพันธุ์ของทั้งข้าวบาร์เลย์และยาสูบ การล้มเหลวของการค้นพบต้นกลายพันธุ์ของ GO ต่อการคัดเลือก photorespiration ใน Arabidopsis และข้าวบาร์เลย์นั้นอาจจะสะท้อนให้เห็นถึงความเป็นไปได้ของยีนที่มากเกินความจำเป็นของยีนสองชนิดหรือมากกว่าที่เกี่ยวข้องกับ GO นอกจากนี้ยังพบการทำงานที่ทับซ้อนกันของ mitochondrial GLYDH อีกด้วย

 

 

 

Glyoxylate เป็นตัวยับยั้งเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการเกิด photorespiration เช่น RubisCO ดังนั้นจึงได้การจำแนกยีนใน Arabidopsis จำนวน 2 ยีนที่เกี่ยวข้องกับเอนไซม์ aldehyde reductases ซึ่งเกี่ยวข้องกับ glyoxylate ใน micromolar range โดยได้สนับสนุนหลักฐานการศึกษาทางชีวเคมีที่รายงานมานานแล้วว่า glyoxylate reductase (GLYR) ทำหน้าที่ reduce บางส่วนของ glyoxylate ไปเป็น glycolate ซึ่งเหมือนกับยีน GLYDH และ CAT2 โดยทั้งยีน GLYR2 (chloroplast) และ GLYR1 (cytosolic) จะถูกพบในยีนกลุ่มที่ 2 ซึ่งแสดงไว้ในภาพที่ 8

 

3.4. Re-engineering photosynthesis system C3(พันธุวิศวกรรมในการเปลี่ยนข้าวC3ไปเป็นC4)

ปัจจุบันประชากรโลกมีจำนวนเพิ่มมากขึ้นอย่างรวดเร็วในขณะเดียวกันพื้นที่สำหรับการเพาะปลูกได้ลดลงอย่างต่อเนื่อง ทำให้มีการคาดการณ์กันว่าโลกอาจจะประสบกับปัญหาวิกฤตการขาดแคลนอาหารได้ในปี ค.ศ. 2050 (Dawe, 2000; Sheehy et al., 2007) ในการเพิ่มปริมาณอาหารให้ได้เพียงพอกับประชากรโลกที่เพิ่มขึ้นนั้นแนวทางหนึ่งคือการเพิ่มผลผลิตพืช ซึ่งพืชสร้างผลผลิตได้ก็โดยผ่านการสังเคราะห์แสง เป็นที่ทราบกันดีว่าพืช C4 เช่นข้าวโพดและอ้อย มีความสามารถในการสังเคราะห์แสงสูงกว่าพืช C3 และสาเหตุที่เป็นเช่นนั้นอาจเป็นไปได้ว่าเพราะว่าพืช C4 มีอัตราการหายใจเชิงแสงต่ำ (Hatch, 1987) ยิ่งไปกว่านั้นถ้าหากเพาะปลูกในบรรยากาศที่เหมาะสม พืช C4 สามารถสร้างผลผลิตได้มากกว่าพืช C3 ดังนั้นจึงอาจกล่าวได้ว่าผลผลิตของพืชอาจจะเพิ่มขึ้นได้ถ้าสามารถทำให้พืชมีการสังเคราะห์แสงได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น ฉะนั้นการพัฒนาระบบการสังเคราะห์แสงแบบ C4 ให้กับพืช C3 นั้นจึงน่าจะทำให้ผลผลิตจากการสังเคราะห์แสงเพิ่มขึ้นได้

 

Burnell (2011) ได้เสนอว่ามีสองแนวทางที่มีความเป็นไปได้ในการใช้ผลประโยชน์ของระบบการสังเคราะห์แสงแบบ C4 ในการเพิ่มพูนผลผลิตทางด้านอาหาร แนวทางแรกคือ โดยการใช้พืช C4 ที่ไม่ได้เป็นพืชปลูกมาดัดแปลงพันธุกรรมให้สามารถสร้างผลิตผลได้เหมือนพืชปลูก โดย Burnell ได้ยกตัวอย่างที่ Sage (2000) ได้เสนอไว้คือ พืชอย่างหญ้าข้าวนก (Echinodhloa crusgalli) ซึ่งเป็นพืช C4 อาจนำมาปรับปรุงพันธุ์ให้สร้างเมล็ดคล้ายกับเมล็ดข้าวได้ อีกแนวทางหนึ่งคือ ดัดแปลงพันธุกรรมพืชปลูก C3 ให้มีระบบการสังเคราะห์แสงแบบ C4 ซึ่งแนวทางที่สองนี้อาจมีความเป็นไปได้สูงถ้ามองในแง่ที่ว่า พืช C4 นั้นได้วิวัฒนาการมาจากบรรพบุรุษที่เป็นพืช C3 ซึ่งได้มีการศึกษาพบว่าโอกาสของการวิวัฒนาการมีได้มากกว่า 50 ครั้งด้วยกัน และเกือบ 20 ครั้งพบในพืชตระกูลหญ้า ในปัจจุบันมีพืชปลูกหลัก ๆ ที่เป็น C4 อยู่ 4 ชนิดที่ผลิตอาหารที่มนุษย์สามารถบริโภคได้โดยตรง ได้แก่ ข้าวโพด อ้อย ข้าวฟ่าง และ millet ถ้าไม่นับข้าวโพดและข้าวฟ่าง ผลผลิตที่เป็นเมล็ดหลัก ๆ ที่มนุษย์สามารถบริโภคได้โดยตรงล้วนมาจากพืชปลูก C3 อาทิเช่น ข้าว ข้าวสาลี ข้าวบาร์เลย์ ข้าวโอ๊ต และถั่ว (Brown, 1999) และเนื่องจากประชากรโลกส่วนใหญ่บริโภคข้าวเป็นอาหารหลัก การทำให้ข้าวสามารถเพิ่มผลผลิตได้มากขึ้นโดยการพัฒนาให้ข้าวมีระบบการสังเคราะห์แสงแบบ C4 น่าจะเกิดผลดีที่สุด

 

 

 

Burnell (2011) ได้เสนออีกว่าในการปรับปรุงให้เกิดวิถีการสังเคราะห์แสงแบบ C4 ในพืชที่ต้องอาศัยเซลล์สองชนิด (คือ เซลล์ mesophyll: M และเซลล์ bundle sheath: BS) สิ่งที่จะต้องพิจารณาหลัก ๆ มีดังนี้

1. CO2 จะต้องถูกเปลี่ยนให้เป็น HCO3- ในเซลล์ M
2. PEPC ต้องมี activity ที่สูงแต่ต้องจำกัดอยู่เฉพาะภายในเซลล์ M เท่านั้น
3. การหมุนเวียนหรือสร้างใหม่ของ PEP ต้องเกิดขึ้นอย่างรวดเร็วเพื่อก่อให้เกิดปฏิกิริยาการรวมตัวกับ HCO3
4. OAA จะถูกเปลี่ยนไปเป็น malate และ/หรือ aspartate ก่อนที่จะเกิดการแพร่เข้าสู่เซลล์BS
5. malate หรือ aspartate อย่างใดอย่างหนึ่งหรือทั้งสองอย่าง ต้องแพร่อย่างรวดเร็วจากเซลล์ M เข้าสู่เซลล์ BS
6. ปฏิกิริยา decarboxylation ของกรด C4 จะต้องเกิดขึ้นในคลอโรพลาสต์, ไมโตคอนเดรีย หรือ cytosol ของเซลล์ BS
7. Rubisco และวัฏจักร PCR ต้องมีการทำงานและถูกจำกัดอยู่ในคลอโรพลาสต์ของเซลล์BS
8. สารประกอบที่มีคาร์บอน 3 อะตอม ที่ถูกปลดปล่อยในขณะการเกิด decarboxylation ในเซลล์ BS จะต้องถูกส่งกลับคืนเซลล์ M และจะต้องถูกเปลี่ยนไปเป็น PEP ที่นั่น ก่อนที่จะถูก decarboxylate ไปเป็น OAA ต่อไป

 

 

 

การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้จะทำให้ได้วิถีแบบ C4 ที่ทำงานเป็นลักษณะปั๊มทางชีวเคมี (biochemical pump) ซึ่ง RubisCO จะนำไปใช้ในกระบวนการสังเคราะห์แสงได้อย่างเต็มที่และลดอัตราการหายใจเชิงแสง ในพืช C3 ประสิทธิภาพของ carboxylation ต่ำและพืช C3 ต้องทำการชดเชยการที่ RubisCO มีความจำเพาะต่อ substrate ต่ำด้วยการสังเคราะห์ RubisCO มากขึ้นเพื่อให้เพียงพอ (Dey et al., 1997) ปริมาณของ RubisCO จะถูกสร้างขึ้นมากถึง 30 เปอร์เซ็นต์ของโปรตีนทั้งหมดที่สร้างในใบของพืช C3 (Sage et al., 1987) พืช C4 สามารถเกิด carboxylation ได้อย่างมีประสิทธิภาพได้ดีกว่าพืช C3 มาก พืช C4 จึงไม่จำเป็นต้องสร้าง RubisCO ขึ้นมามากมาย ดังนั้นจึงสามารถใช้ไนโตรเจนไปสร้างเป็นโปรตีนชนิดอื่นแทนที่จะต้องนำมาสร้าง RubisCO เหมือนในพืช C3 ด้วยเหตุนี้พืช C4 จึงใช้ไนโตรเจนได้อย่างมีประสิทธิภาพ (Brown, 1999; Long, 1999) ยิ่งกว่านั้น จากการที่พืช C4 เปลี่ยน CO2 ไปเป็น HCO3-ก่อนแล้วจึงตรึง HCO3- ผ่านทาง PEPC (ซึ่ง O2 จะไม่ส่งผลกระทบในกระบวนการนี้) ทำให้พืช C4 สามารถอยู่รอดได้ในสภาวะที่มี CO2 ต่ำและสามารถอยู่รอดได้แม้จะมีการเปิดปากใบน้อยกว่าเมื่อเทียบกับพืช C3 ซึ่งจะลดอัตราการสูญเสียน้ำออกทางปากใบต่อหน่วยของคาร์บอนที่ถูกตรึง จึงทำให้พืช C4 สามารถใช้น้ำได้อย่างมีประสิทธิภาพอีกด้วย (Hatch, 1987)

 

 

 

การที่พืช C3 มีประสิทธิภาพการสังเคราะห์แสงต่ำเนื่องจากเหตุผลหลักคือพืช C3 มีการหายใจเชิงแสง แม้ว่าได้มีความพยายามในการเพิ่มความจำเพาะเจาะจงของ RubisCO ที่มีต่อ CO2 เพื่อลดการหายในเชิงแสง แต่ผลที่ได้กลับไปลดอัตรา catalytic turnover ของ RubisCO และทำให้การสังเคราะห์แสงผิดปรกติไป (Parry et al., 2003; Zhu et al., 2004) แต่ก็ยังพอมีหวังในการที่จะลดความไม่จำเพาะเจาะจงกับสารตั้งต้น (substrate specificity) ของ RubisCO ถ้าสามารถค้นหา RubisCO ที่มีความจำเพาะกับ CO2 ได้ โดยทั้งนี้ได้มีการค้นหา RubisCO ชนิดดังกล่าวแล้วทั้งในสาหร่ายและในพืชชั้นสูง (Whitney et al., 2001; Tabita, 1994) แต่ความพยายามในการเพิ่มประสิทธิภาพการสังเคราะห์แสงในพืช C3 โดยการส่งถ่าย RubisCO ชนิด II (Type II RubisCO) เข้าสู่พืชกลับไม่ประสบความสำเร็จเนื่องจากการที่ RubisCO แปลกปลอมไม่สามารถที่จะประกอบเข้าเป็นโปรตีนที่สามารถทำหน้าที่ได้ (Parry et al., 2003)

 

 

 

บทสรุปของการควบคุมการทำงานของยีนใน M และ B cells

การสะสมของโปรตีนสำหรับการสังเคราะห์แสงในเซลล์ M หรือเซลล์ BS ของพืช C4 เกี่ยวข้องกับหลายระดับในการควบคุมทั้งระดับ transcription, post-transcription, translation และ post-translation กลไกที่ควบคุม M-specificity หรือ BS-pecificity ได้ถูกค้นพบแล้วบางส่วนสำหรับบางยีน แต่ก็ยังมีอีกมากที่จะต้องทำการศึกษาต่อไป สามารถสรุปเกี่ยวกับการควบคุมการทำงานของยีนในเซลล์ M และ BS ได้ดังนี้

1. ประสิทธิภาพของการถอดรหัส (transcription), กระบวนการหลังการถอดรหัส (post-transcription) และการแปลรหัส (translation) มีความเกี่ยวข้องกันเพื่อที่ทำให้เกิดการสะสมของโปรตีนในเซลล์ M และเซลล์ BS ที่ต้องการในวัฏจักร C4

2. Golden 2 (G2) และ Golden1-like protein มีบทบาทในการควบคุมการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์แสงทั้งในพืช C3 และ C4

3. Promoter ของยีน PEPC และ PPDK ในข้าวโพด และยีน cytosolic aspartate aminotransferase (AspAT) ของ Panicum miliaceum ทำให้เกิดการสะสมใน M-specific ของ reporter ในข้าว นอกจากนี้ promoter ของยีน PEPC และ glycine decarboxylase P-subunit (GDCP) จาก Flaveria bidentis ทำให้เกิดการสะสมแบบ M และ BS-specific ตามลำดับ นักวิจัยยังมีความรู้ไม่มากนักสำหรับยีนที่ถอดรหัสให้โปรตีนเหล่านี้ในพืช C3 ต่อการแสดงออกของเซลล์เฉพาะเจาะจงในชนิดพืชเหล่านั้น

4. cis-element ที่เกี่ยวข้องในเซลล์ที่เฉพาะเจาะจงได้ถูกพบแล้วในบางยีนของ C4 แต่ transcription factors ยังคงไม่ทราบ ตัวอย่างเช่น mesophyll enhancing module (MEM1) มีผลโดยตรงต่อการแสดงออกของ reporter ใน M-specific ของ Flavenia bidentis

5. ยีนที่ไม่มีการเปลี่ยนแปลง (conserved genes) ที่มีความใกล้ชิดกับพืช C4 ได้ถูกศึกษาและมีการแสดงออกที่สูงในพืช C3 ที่มีความใกล้ชิดกันทางพันธุกรรม

6. การนำบางส่วนของสิ่งมีชีวิตเซลล์เดียวที่เป็น C4 ถ่ายเข้าไปสู่ข้าวโดยการแสดงออกของเอนไซม์ 4 ชนิดของวัฏจักร C4 ในเซลล์เมโซฟิลล์ พบว่า ไม่ได้ทำให้มีปริมาณ flux เพิ่มขึ้นผ่านวัฏจักรของ C4

 

 

 

ตารางที่ 2 สรุปรายชื่อของยีนที่เกี่ยวข้องกับขบวนการสังเคราะห์แสงแบบC4โดยแสงและการพัฒนาการ

Protein   Species Identified genes C4 accession number Summary of light and developmental regulation β-CA Flaveria bidentis CA1, CA2, CA3 (72, 131) AY167113 N/A Maize CA1, CA2 (17) U08403 Activity increases along the leaf developmental gradient from base to tip. In the dark, activity is less than 1% of that in the light and increases rapidly after a dark-to-light transition. However, its activity is not subject to dark inactivation Sorghum Tandem duplication:Sb03g029170, Sb03g029180, Sb03g029190, Sb03g029200 (141). Sb03g029170 has 13 exons and an internal repeat structure and is likely a fusion of 2 neighbouring CA genes. The first exon contains a chloroplast targeting peptide. Sb03g029180 has only 6 exons and lacks the cTP. Sb03g029200 is likely a pseudogene because it is truncated and has a DNA insertion as well as point mutations. Sb03g029190 has a normal gene structure but does not group with C4 CA genes found in maize when analyzed phylogenetically   Sb03g029170 corresponds to two previously identified cDNAs, HHU69 and HHU22 (146). Expression of these cDNAs is light-inducible and restricted to M cells PEPC Flaveria trinervia PpcA, PpcB, PpcC (44, 45, 99) X61304 When the FtPpcA promoter is fused to uidA and transformed into F. bidentis, promoter activity spreads from leaf base to tip. Proximity of the M cell to the BS affects the intensity of staining, with greater distances resulting in little to no GUS Maize Pepc1, Pepc2, and Pepc3(111) NM 001111948 PEPC expression is light regulated (89) and PEPC localization becomes restricted to M cells during development (64, 78). Light causes an increase in PEPC1 transcription and in the amount of heteronuclear and translatable RNA (37, 43, 53, 120). Regions 5_ to thePEPC1 gene have been implicated in its response to light. The nuclear factors PEP-I, MNFs, and Dof1&2 have been shown to bind the PEPC1 promoter and are likelyimportant for light regulation. Dof2 is thought to repress Dof1 in nonphotosynthetic tissues. Alterations in chromatin associated with PEPC1 have been implicated in the response to light Sorghum Sb10g021330 (141) X17379, X63756 PEPC expression is responsive to a dark-to-light switch and under phytochrome control MDH Flaveria spp. MDH (86) F. bidensis: L40958 F. trinervia: U22533 N/A Maize MDH (88) X16084 Transcript accumulation is light induced Sorghum MDH1, MDH2 arranged in tandem (22, 71). Designated loci in genome: Sb07g023920 and Sb07g023910, respectively (141). X53453, M31965 MDH1 is induced by light. MDH2 transcripts are expressed in a more constitutive manner and are less abundant relative to MDH1 NADP-ME F. trinervia and F. bidentis NADP-ME1 (ChlMe1),NADP-ME2 (ChlMe2) (76, 102) F. trinervia: AF288919 F. bidentis: AF288899 NADP-ME1 transcript accumulation is restricted to leaves,light regulated, and synchronized with the onset of C4 metabolism Maize NADP-ME1, NADP-ME2. NADP-ME1 is also known as Me3 and Mod1 (109, 129) NM 001111843 Transcripts are detectable in etiolated leaves but abundance increases fivefold upon greening. Accumulation is most marked in plastochrons 6 to 7. UV-B and red/far red light are involved in ME1 regulation in etiolated seedlings Sorghum Sb03g003230, plus two additional orthologous pairs of genes AY274836 N/A PPDK F. trinervia PPDK X57141 Accumulation of transcripts encoding plastidic transcript PPDK are light regulated Maize PPDK1 (encodes C4PPDKZM1 and CYPPDKZM1), PPDK2(34, 82, 113) NM 001112268 Synthesis of C4 PPDK protein is most significant at 2 to 4 cm from the base of the leaf (84). Elements −1300 to +72 of PPDK1 generate light-responsive expression in protoplasts Sorghum Sb09g019930, Sb01g031660   Sb09g019930 gene structure is similar to maize SSU F. bidentis RbcS1, RbcS2 AY267350, AY267351   Maize RbcS multigene family(115) ssu1 locus: NM 001111824 RbcS expression is light regulated (89). Stimulation of transcript abundance in response to light occurs within 24 h and RbcS transcripts accumulate coincident with basal to apical leaf development (84). SSU only accumulates in mature leaf tissue, but RbcS mRNA is detectable before the BS is fully differentiated. Transcripts of RbcS accumulate differentially in C3-(husk) and C4-(leaf) type tissues Sorghum Sb05g003480, Sb08g001646   N/A Amaranthus Hypochondriacus RbcS X87171 Transfer to light leads to a large increase in abundance of RbcS transcripts and an association of RbcS transcripts with polysomes. During periods of extended darkness,rates of SSU synthesis decline more significantly than the abundance ofRbcS transcripts, although the transcripts remain attached to polysomes LSU Flaveria spp. and A. hypochondriacus rbcL F. bidentis: X55830 A. hypochondriacus: X51964 Light is required to induce high levels of rbcL accumulation but not to initiate transcription, indicating a developmental signal is necessary for expression. Unlike SSU, LSU accumulation in Amaranth cotyledons is similar in the dark and light and precedes SSU detection. In leaves, patterns of rbcL accumulation overlap with those of RbcS Maize rbcL ZemaCp032 rbcL expression is regulated by light and veinspacing Sorghum SobiCp030   N/A Polypeptides of PSII Maize, sorghum, sugar cane, pennisetum, F. trinervia Plastid and nuclear encoded   During leaf development PSII activity and the abundance of transcripts encoding PSII components decrease in BS cells. Light intensity and environment appear to influence the degree to which PSII activity and accumulation is repressed in the BS of F. trinervia NAD-ME A. hypochondriacus NAD-ME U01162 NAD-ME is expressed very early in leaf development and is highly light-dependent, and run-ons show this is partly due to a light-stimulated increase in transcription. The rate of protein synthesis after transfer of light-grown leaves into the dark decreased more dramatically than the abundance of transcripts , indicating regulation at the level of translation as well PEPCK Maize PCK AB018744 PCK is abundant in BS cells of maize, a NADP-ME C4 plant. The transcript accumulates to higher levels in the day than at night and increases over the course of seedling development PPDK-RP Maize PDRP1 NM 001112403 N/A Sorghum Sb02g035190, tandem paralogues Sb02g035200 and Sb02g035210   N/A PEPC-kinase (PPCK, PEPCk) F. trinervia PEPC-K, additional genes likely AB065100 PEPC-K transcripts are detectable in the light but not during the night. Expression is higher in F. trinervia than in the C3 F. pringlei Maize PPCK1, PPCK2, PPCK3, PPCK4 NM 001112338 PPCK1 transcripts are most abundant in the light. PPCK2 transcripts preferentially accumulate in BS cells in the dark. PPCK3 and PPCK4 transcripts are less abundant than PPCK1 and -2 Sorghum Sb04g036570 (PPCK1), Sb04g026490 (PPCK2), Sb06g022690 (PPCK4) DQ386731 PPCK1 expression is light regulated

 

ข้อแนะแนวทางสนับสนุนการวิจัยข้าวทนร้อน

เพิ่มการเพิ่มประสิทธิภาพการสังเคราห์แสงและเส้นทางงานวิจัยข้าวเพื่อปรับปรุงระบบการสังเคราะห์แสงภายใต้สภาวะโลกร้อน

 

ประชุมระดมความคิดเห็น

เพื่อให้สถานภาพงานวิจัยข้าวไทย และระดมแนวความคิดในการพัฒนางานวิจัยในอนาคต จึงได้จัดการประชุม ระดมความเห็น เมื่อวันที่ 30 ก.ค. 2555 และมีข้อสรุปจากการประชุมดังกล่าว

 

สรุปผลการประชุมระดมความคิดเห็น

เทคนิคการวัดอัตราการสังเคราะห์แสง, การหายใจเชิงแสง และการหยุดการสังเคราะห์แสง พบว่าเทคนิคทั่วไปมีสัดส่วน คือ การวัดค่า light response กับ CO2 response ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับ อัตราการสังเกตุแสงของใบ, พื้นที่่ใบ, อายุของใบ การกระจายแสงในเรือนพุ่ม ปัจจัยสิ่งแวดล้อม และปัจจัยภายใน เครื่องที่ใช้วัดการสังเคราะห์แสง เช่น Photosynthesis system (Licor 6400) หรือ Fluor pen ที่สามารถวัด Chlorophyll fluorescence ได้เร็ว การใช้ Carbon isotope discrimination เพื่อบ่งบอก affinity ของปฏิกิริยา Oxygenase & Carboxylase ของ Rubisco ซึ่งขีดความสามารถของนักวิจัยไทยในการวัด Carbon isotope ยังมีไม่มากนัก รวมทั้งเครื่องวัดอัตราการสังเคราะห์แสงยังมีน้อยมาก ในส่วนของ photorespiration อาจจำเป็นต้องพัฒนาวิธีการคัดกรอง CO2 compensation point เพื่อคัดเลือกข้าวกลายพันธุ์ที่ยังคงระดับการสังเคราะห์แสงได้ดีที่อุณหภูมิสูงและมีปริมาณ CO2 ต่ำกว่าปกติ เช่น ง CO2 compensation chamber

 

จำนวนและขีดความสามารถนักวิจัยข้าวของไทยในปัจจุบัน การประเมินขีดความสามารถของนักวิจัยด้านข้าวในปัจจุบันได้โดยดูจากการเสนอผลงานการประชุมแห่งชาติครั้งที่1 เมื่อวันที่15-17 ธ.ค. 2553 เราพอจะเห็นสภาพที่แท้จริงว่า ปัจจุบันเรามีนักวิจัยเชิงลึกมากน้อยเพียงใด ในจำนวนผู้เสนอผลงานจำนวน 115ท่านจาก120หัวข้อเรื่อง มีเพียง41หัวข้อเรื่องที่เกี่ยงข้องกับเทคโนโลยีชีวภาพข้าว หรือประมาณ30%ของหัวข้อ แต่หากนับจำนวนนักวิจัยจะพบว่าใน41หัวข้อเรื่องนี้ มาจากนักวิจัยเพียง10คน ในหัวข้อทั้ง41หัวข้อ ยังไม่มีการศึกษาด้านระบบการสังเคราะห์แสงภายใต้สภาวะโลกร้อนแต่อย่างใด นั่นแสดงว่าจำเป็นจะต้องมีการปรับปรุงทั้งด้าน จำนวนและคุณภาพของนักวิจัย (human capacity) และทุนสนับสนุนการวิจัย เพื่อให้งานวิจัยมีความก้าวหน้า จากสมมุติฐานดังกล่าวจึงนำไปสู่แผนที่เส้นทางการพัฒนางานวิจัยเป็นคู่ขนานกับ เส้นทางการพัฒนานักวิจัยและเส้นทางการให้ทุนวิจัย ที่ประชุมได้ให้ความสำคัญของการพัฒนาบุคคลากรวิจัย โดยอาจเริ่มจากการสร้าตำแหน่ง Post-doc ที่มีประสบการณ์จากต่างประเทศในการวัดและวิเคราะห์ระบบการสังเคราะห์แสง และทำงานร่วมกับนักวิจัยไทย ในแง่ของบัณฑิตศึกษาอาจมีโครงการลักษณะคล้าย โครงการกาญจนาพิเศษเพื่อให้นักศึกษามีประสบการณ์วิจัยร่วมกับห้องปฏิบัติการที่เชียวชาญด้านนี้ ในต่างประเทศร่วมทั้งการให้ทุนอาจารย์ที่มีศักยภาพไปเยี่ยม, ดูงาน หรือฝึกงานในห้องปฏิบัติการที่เชียวชาญในต่างประเทศ

 

การจัดลำดับความสำคัญ ที่ประชุมให้ความสำคัญของการปรับปรุงพันธุ์ข้าวเพื่อลดการหายใจเชิงแสง(photorespiration) และ การยับยั้งการสังเคราะห์แสง(photoinhibition)เท่าเทียมกัน โดยมองเห็นศักยภาพของฐานพันธุกรรมข้าวสองชนิดคือ ฐานพันธุกรรมข่าวไร่(ทั้งเขตที่สูงและภาคใต้) และประชากรข้าวกลายพันธุ์ โดยเฉพาะข้าวพันธุ์กลายที่ทนร้อนในระดับมากกว่า 40 - 48 oC ในเบื้องต้นก็มีโครงการข้าวทนร้อนในระยะสืบพันธุ์ของข้าวนำโดย ดร.พูนพิภพ (ARDA) ได้ข้าวพันธุ์กลายที่ทนร้อนสามารถติดเมล็ดที่ระดับอุณหภูมิ 42 oC เพื่อที่จะได้ข้าวพันธุกรรมทนร้อนในระดับการสังเคราะห์แสงจำเป็นต้องมีการพัฒนาเทคนิคการคัดกรองพันธุ์ข้าวจำนวนมากในสภาวะอุณหภูมิสูงที่จะเกิด photorespiration/photoinhibition ได้ เช่น การวัด Chlorophyll fluorescence อย่างรวดเร็ว และการมีระบบตรวจวัดอัตโนมัติ เช่น Trademill system เป็นต้น

 

 

การจัดกลุ่มหัวข้องานวิจัยข้าวเพื่อปรับปรุงระบบการสังเคราะห์แสงภายใต้สภาวะโลกร้อน

จากรายงานสรุปสถานะภาพงานวิจัยและการระดมความคิดจากนักวิชาการน่าจะมีการจัดกลุ่มหัวข้อวิจัยเป็น 3 กลุ่มใหญ่ๆ ดังนี้

 

 

กลุ่มงานวิจัย 1 photoinhibition-proof rice : การปรับปรุงพันธุ์ข้าวให้มีระบบการสังเคราะห์แสงที่ทนทานต่อสภาวะ photoinhibition/ photooxidation ภายใต้สภาวะโลกร้อน

กรอบโครงการควรประกอบด้วย

1.1 พัฒนาฐานพันธุกรรมประชากรข้าวพันธุ์กลายขนาดใหญ่ โดยการอาบรังสี เพื่อค้นหาพันธุ์ข้าวที่ทนทานต่อสภาวะ photoinhibition และ photorespiration

1.2 พัฒนาเทคนิคในการคัดกรองข้าวที่ทนทานต่อสภาวะ photoinhibition/ photorespiration ในสภาวะเครียดต่างๆ เช่น อุณหภูมิสูง, ขาดน้ำ, น้ำท่วม

1.3 ค้นหายีนที่เกี่ยวข้องในแบบ Reverse และ Forward Screening ต่อลักษณะความทนทานต่อสภาวะ photoinhibition ภายใต้สภาวะโลกร้อน

1.4 การปรับปรุงพันธุ์ข้าวนาปรังที่มีผลผลิตสูงให้ทนทานต่อสภาวะ photoinhibition ภายใต้สภาวะโลกร้อน โดยใช้พันธุ์กลายข้างต้น

 

 

 

กลุ่มงานวิจัย 2 photorespiration-proof rice : การปรับปรุงพันธุ์ข้าวที่ลดทอน photorespiration ภายใต้สภาวะโลกร้อน

2.1 พัฒนาเทคนิคการคัดกรองข้าวพันธุ์กลายที่ลดทอน photorespiration ในสภาวะที่มี enriched O2 เปรียบเทียบกับ ambient O2 และ low O2

2.2 ประเมินความดีเด่นด้าน photorespiration และ photoinhibition ของข้าวพันธุ์กลาย เพื่อนำไปสู่การค้นหายีนที่ควบคุมลักษณะดังกล่าว

2.3 การปรับปรุงพันธุ์ข้าวนาปรังที่มีผลผลิตสูง ที่ลดทอน photorespiration โดยใช้ข้าวพันธุ์กลายที่คัดเลือกได้

 

 

 

กลุ่มงานวิจัย 3 C4-like rice : การปรับปรุงพันธุ์เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการสังเคราะห์แสงคล้ายC4

ด้าน Re-engineering C3 to C4 rice พบว่าเป็นงานวิจัยที่ลงทุนสูงที่สุดขณะนี้ เป็นโครงการที่มีเงินลงทุนขนาดใหญ่มาก แต่มีความก้าวหน้าในระยะเริ่มต้นเท่านั้น ซึ่งทำให้พบสิ่งที่ยังไม่ทราบอีกมากมาย ประเด็นที่สำคัญคือ การเปลี่ยนข้าวจาก C3 เป็น C4 ต้องใช้ GM technology เท่านั้น เนื่องจากไม่มี C4 ตามธรรมชาติ ทั้งในข้าวป่าและข้าวปลูก ดังนั้นจึงควรมีการเลือกศึกษาในส่วนข้าวกลายพันธุ์และพืชต้นแบบอื่นที่ใกล้เคียงกับข้าว เพื่อกระตุ้นให้เกิดการศึกษาพื้นฐานให้มากที่สุด

 

 

 

3.1 การคัดกรองฐานพันธุกรรมทั้งข้าวปลูกและข้าวป่า และประชากรข้าวพันธุ์กลายขนาดใหญ่

เพื่อค้นหาข้าวที่มีความหนาแน่นของเส้นใบ (vein density) ที่หนาแน่น เส้นใบของพืช C4 มีความถี่กว่า C3 มาก อันเนื่องมาจากสัดส่วนของ bundle sheath (BS) ต่อ mesophyll (MS) ที่ใกล้เคียงกัน ในขณะที่ข้าว C3 ส่วนของ MS จะมีสัดส่วนสูงกว่า BS และวางตัวเรียงลำดับกัน โครงสร้างแบบนี้ทำให้ leaf vein ข้าว C3 วางตัวกันห่างๆ ทำให้ประสิทธิภาพในการส่งผ่านระหว่าง Sink-Source ต่ำกว่าพืช C4

 

 

 

3.2 ทำการคัดกรองข้าวกลายพันธุ์ที่มี CO2 composation point ต่ำลงโดยใช้ Low- CO2 chamber microscopy ด้วย เพื่อค้นหา candidate gene และข้าวที่มีอัตราการสังเคราะห์แสงสูงภายใต้สภาวะกดดันต่างๆ

 

 

 

3.3. พืช C3-C4 intermediate ในข้าวป่าและพืชต้นแบบ

ค้นหาปัจจัยที่ควบคุมการเกิดขึ้นของลักษณะ Kranz anatomy ประเทศไทยจึงควรหาพืชต้นแบบที่ใกล้เคียงกับข้าว เช่น ข้าวฟ่าง (sorghum millet หรือ หญ้าข้าวนก) ที่มีความแปรปรวนทาง Kranz anatomy เพื่อพัฒนานักวิจัยของไทยให้เป็นกลุ่มก้อนใหม่ที่น่าสนใจ

 

 

 

3.4 ค้นหาพืชต้นแบบที่ใกล้เคียงกับข้าวที่ไม่มี Kranz anatomy แต่มีอัตราการสังเคราะห์แสงสูงแบบ C4 โดยร่วมศึกษากับห้องปฏิบัติการในต่างประเทศ เช่นที่ University of Washington (Prof. Edwards) ที่ค้นพบพืชในสกุล Chenopodium

จากการประเมินขีดความสามารถของนักวิจัยด้านข้าวในปัจจุบัน ยังไม่มีการศึกษาเพื่อปรับปรุงระบบการสังเคราะห์แสงภายใต้สภาวะโลกร้อนแต่อย่างใด ดังนั้นแผนที่นำทางการพัฒนางานวิจัยต้องเป็นคู่ขนานระหว่างการพัฒนานักวิจัยและการให้ทุนวิจัยที่เป็นไปได้ เพื่อเสริมสร้างความต้านทานของข้าวภายใต้สภาวะ ที่เกิด photoinhibition/ photooxidation

เนื่องจากเป็นโครงการที่ต้องลงทุนมหาศาลและบางส่วนต้องใช้เทคนิคของ GMO จำนวนมาก จึงสมควรทำงานวิจัยกับต่างประเทศเพื่อการเรียนรู้ไปกับวิทยาการใหม่ๆ โดยจัดทุน Ph.D. เพื่อสร้างนักวิจัยไทยร่วมกับห้องปฏิบัติการที่กำลังดำเนินงานวิจัยด้านนี้อยู่ ในขณะเดียวกันให้ทุน Post-doctoral กับ Ph.D. คนไทย ให้ไปทำงานร่วมกับห้องปฏิบัติการในต่างประเทศเพื่อเรียนรู้วิทยาการใหม่ๆ

 

 

3.5. พัฒนา systems biology infrastructure สำหรับพืช C4 และ rice transcriptome และ phenome data

• สร้างแบบจำลองทั้งแบบ dynamics และ chemical kinetic C3 และ C4
• พัฒนา pipeline สำหรับค้นหา transcription factor และ binding sites ที่เกี่ยวข้องกับ photosynthesis
• พัฒนาโปรแกรมทำนาย microRNA จาก small RNA data

 

 

 

3.6. ค้นหาข้าวที่มีลักษณะทางโครงสร้างและทางเคมีที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์แสงที่ดี โดยการค้นหาจาก germplasm ข้าวพันธุ์พื้นเมือง หรือข้าวป่า

 

 

 

3.7. ตรวจสอบ C4 enzymes ในข้าว โดยศึกษาถึงตำแหน่ง การทำหน้าที่ และการควบคุมการแสดงออก

 

 

 

3.8. ประเด็นในอนาคต (Future Issue)

• การศึกษาการควบคุมการแสดงออกของยีนในระดับ post-transcriptional โดยบทบาทของ small RNA และ/หรือ transcription factors โดยการค้นหา small RNAs (เช่น siRNAs หรือ micro RNA) ที่ทำหน้าที่ในการระงับการสร้างโปรตีนของยีนโดยการเข้าทำลาย mRNA อย่างจำเพาะเจาะจง ซึ่งอาจเป็นสาเหตุที่ทำให้เกิดการแสดงออกของยีนที่เกิดขึ้นเฉพาะในเซลล์ M หรือ BS และการศึกษา interaction/interplay ระหว่าง small RNAs และ transcription factors ที่มีต่อยีนในวัฏจักร C4 หรือเกี่ยวกับการเกิดโครงสร้างแบบ Kranz
• การจำแนกยีนที่ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในชีววิทยาของเซลล์ และ Kranz anatomy ที่เกี่ยวข้องกับใบพืช C4
• การจำแนกยีนที่เกี่ยวกับ transporters ที่เกี่ยวข้องกับ intracellular flux ของ metabolites
• การพัฒนาวิธีการคัดแยกเซลล์ M และเซลล์ BS ที่มีประสิทธิภาพเพื่อการศึกษาองค์ประกอบที่แน่นอนของวัฏจักร C4 ที่จำเพาะต่อเซลล์ แทนการใช้วิธีกลและการเตรียม protoplast ในการแยกสายของเซลล์ BS (BS strand) และโปรโตพลาสต์ของเซลล์ M ซึ่งบางครั้งเซลล์ที่ได้ไม่บริสุทธิ์โดยเฉพาะเซลล์ BS เพราะจะมีเซลล์ที่เป็นส่วนของ vein ติดออกมาด้วย ดังนั้นบางองค์ประกอบอาจเป็นผลมาจากเซลล์ BS รวมกับ vein วิธีการ laser capture microdissection อาจจะให้ผลดีกว่าในการคัดแยกเซลล์ ทำให้สามารถศึกษา transcriptomes ของเซลล์ M และเซลล์ BS ได้ชัดเจนยิ่งขึ้น
• การใช้วิธีการหาลำดับเบสแบบสมัยใหม่ (next generation sequencing: NGS) ในการหาลำดับเบส mRNA (เรียกข้อมูลลำดับเบสของ mRNA โดยใช้วิธีการนี้ว่า RNA-seq) ของยีนที่แสดงออกทั้งจีโนม ทำให้สามารถศึกษาการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับวัฏจักร C4 ณ ระดับของ transcriptome ในพืช C4 หลาย ๆ ชนิด ซึ่งก่อนหน้านั้นเป็นเรื่องยากที่จะศึกษาใน genome ที่มีขนาดใหญ่หรือในสิ่งมีชีวิตที่ไม่เคยมีการค้นหาลำดับเบสทั้งจีโนมมาก่อน นอกจากนี้ยังอาจนำมาประยุกต์ใช้ศึกษา transcriptome ของเซลล์ BS และเซลล์ M เพื่อค้นหายีนและการทำหน้าที่ของยีนที่ต่างกันใน BS และ M
• การเปรียบเทียบ transcription profile ในสปีชีส์ที่มีความใกล้ชิดกัน (เช่นอยู่ในวงศ์เดียวกัน) แต่มีระบบการสังเคราะห์แสงแตกต่างกันไปเป็น C3, C4 หรือ C3-C4 intermediate เพื่อศึกษากลไกและวิวัฒนาการในการเกิดเป็นลักษณะ C4 (C4-ness)
• การค้นหา cis-elements ของยีนในวัฏจักร C4 ที่เป็นตัวกำหนดให้ยีนมีการแสดงอย่างจำเพาะเจาะจงในเซลล์ M หรือเซลล์ BS และค้นหา trans-factors ที่จดจำ cis-elements เหล่านั้น โดยการศึกษาเปรียบเทียบ transcription profiles จากพืช C4 หลาย ๆ ชนิดที่มีการหาลำดับเบสที่สมบูรณ์แล้วเช่น ข้าวโพด ข้าวฟ่าง แล้วคัดเลือกยีนที่แสดงออกคล้าย ๆ กันเช่นแสดงออกเฉพาะในเซลล์ M หรือ BS นำยีนเหล่านั้นมาค้นหา over-represented cis-elements ในลำดับเบสส่วน promoter และ UTR ของยีน
• การศึกษากลไกการทำหน้าที่ของยีนโดยใช้พืชโมเดลชนิดใหม่เช่น Setaria viridis ซึ่งมีวงจรชีวิตสั้น และสามารถถ่ายยีนได้ง่ายกว่าพืชโมเดลสำหรับ C4 ที่ใช้กันอยู่ในปัจจุบันเช่นข้าวโพด หรือข้าวฟ่าง
• การใช้ยีนจากข้าวโพดทุกยีนที่มีความสำคัญต่อวัฏจักร C4 ถ่ายเข้าสู่ข้าว เพื่อทำให้มีการแสดงออกในเซลล์ M หรือ BS ของข้าว สิ่งนี้อาจจะช่วยแก้ปัญหากลไกการควบคุมการดำเนินงานของวัฏจักร C4 ในข้าวได้
• เนื่องจากเป็นโครงการที่ต้องลงทุนมหาศาลและต้องใช้เทคนิคของ GMO จำนวนมาก จึงไม่เหมาะสมกับการลงทุนของประเทศ แต่เพิ่มการเรียนรู้ไปกับวิทยาการใหม่ๆจึงควรจัดทุน Ph.D. เพื่อสร้างนักวิจัยไทยร่วมกับห้องปฏิบัติการที่กำลังดำเนินงานวิจัยด้านนี้อยู่ ในขณะเดียวกันให้ทุน Post-doctoral กับ Ph.D. คนไทย ให้ไปทำงานร่วมกับห้องปฏิบัติการในต่างประเทศเพื่อเรียนรู้