3.1 ความสำคัญและความจำเป็นในการพัฒนาข้าวไปสู่พืชC4
ข้าว (Oryza sativa) เป็นพืชเศรษฐกิจที่สำคัญของโลกและเป็นอาหารหลักของประชากรมากกว่าครึ่งหนึ่งของประชากรโลก ปัจจุบันข้าวยังเป็นที่ต้องการของตลาดทั้งภายในประเทศและต่างประเทศ แต่ผลผลิตของข้าวที่ได้ต่อไร่นั้นยังต่ำอยู่ ยกตัวอย่างเช่นที่ประเทศจีน ผลผลิตข้าวเฉลี่ยต่อปีเพิ่มจาก 5.4 t/ha เป็น 6.4 t/ha ระหว่างปี 1987 และ 1997 ซึ่งใช้เวลาเกือบ 10 ปีและยังไม่สามารถเพิ่มผลผลิตให้มากกว่านี้ได้ ในระหว่างปี 1997 ถึง 2007 (Peng et al. 2009) จึงมีการปรับปรุงพันธุ์ข้าวให้มีผลผลิตที่สูงขึ้นโดยใช้เทคนิคต่าง ๆ รวมทั้งเทคนิคสมัยใหม่ทางด้าน molecular biology ดังที่ทราบกันดีว่าการเพิ่มกลไกในกระบวนการสังเคราะห์แสงนั้นเป็นพื้นฐานในการเพิ่มผลผลิต นักปรับปรุงพันธุ์ส่วนใหญ่จึงมุ่งเน้นปรับปรุงพันธุ์โดยเพิ่มกระบวนการสังเคราะห์แสงให้ข้าวเพื่อที่จะได้ผลผลิตที่มากกว่าเดิม นอกจากนี้อาจทำให้พืชสามารถใช้น้ำและไนโตรเจนได้อย่างมีประสิทธิภาพอีกด้วย (Miyao, 2003) เป็นที่น่าสนใจว่าถ้าพืช C3 ถูกตัดแต่งพันธุกรรมให้มีอัตราการสังเคราะห์แสงคล้ายพืช C4 อาจจะช่วยให้ข้าวมีอัตราการสังเคราะห์แสงเพิ่มขึ้นและมีผลผลิตที่เพิ่มขึ้น นอกจากนี้การคัดเลือกพันธุ์ที่ทนต่ออุณหภูมิสูงและแสงแดดที่มากกว่าปกติ อาจจะช่วยในการคัดเลือกสายพันธุ์ที่ให้ผลผลิตที่มากกว่าเดิมได้
ในตอนนี้มีอยู่ 2 สมมติฐานที่เกี่ยวกับกระบวนการสังเคราะห์แสงแบบ C4 สมมติฐานที่หนึ่งเสนอว่า C4 phtotosynthesis มีการวิวัฒนาการอย่างช้า ๆ ยกตัวอย่างเช่นพืช C3 เปลี่ยนแปลงเป็น C4 แบบค่อยเป็นค่อยไป และสุดท้ายเปลี่ยนรูปแบบการสังเคราะห์แสงไปเป็น C4 photosynthesis (Sage 2004) เรียกสมมติฐานนี้ว่า “incremental gain” ยกตัวอย่างเช่น การลดลงของพื้นที่ระหว่างเส้นใบและกระตุ้น BS ส่วนมากจะสังเกตเห็นได้ในพืชที่ปรับตัวให้เข้ากับความแห้งแล้งโดยเฉพาะบางสายพันธุ์ที่มีลักษณะใกล้เคียงกับพันธุ์ C4 (Sage 2001; Sanchez-Acebo 2005) เป็นที่น่าตื่นเต้นเมื่อพบพืช Parthenium hysterophorus (L.) มีลักษณะกายภาพของ Kranz (Hegde and Patil 1981) อีกสมมติฐานแย้งว่า C4 photosynthesis มีวิวัฒนาการมาจาก mutation คือสมมติฐาน “master switch” ความเหมือนกันของชีวเคมีของระบบ C4 และกายวิภาคแบบ Kranz ในพืชเหล่านั้น แสดงให้เห็นว่าเหตุการณ์ mutation อาจจะเป็นอาการผิดปกติแบบ C4 syndrome งานวิจัยทั้งสองแบบนี้เน้นที่ต้องตัดแต่งพันธุกรรมข้าว ตามแบบของสมมติฐานสองแบบนี้ ถ้าจะวิจัยเน้นที่สมมติฐานแบบ “incremental gain” โดยการสร้างข้าว C4 ต้องการการตัดแต่งพันธุกรรมองค์ประกอบที่สำคัญของ C4 photosynthesis เกือบทั้งหมด ลงไปยังพันธุ์ข้าว แล้วศึกษากายวิภาคของใบและกระบวนการขนส่งที่เกี่ยวข้องที่จำเป็นต่อ C4 photosynthesis ซึ่งจะช่วยให้เข้าถึงการควบคุมทางพันธุกรรมของกายวิภาคแบบ Kranz การก่อตัวของคลอโรพลาสต์ และรายละเอียดในการควบคุมกระบวนการเผาผลาญและขนส่งระดับเซลล์ สำหรับงานวิจัยที่เน้นสมมติฐานแบบ “master switch” นั้นสร้างข้าว C4 โดยการจำแนกยีนที่ต้องการสำหรับการเชื่อมโยงต่อการเกิด C4 ในกระบวนการ differentiation
ในปี 2006 ได้มีการประชุมซึ่งจัดโดยสถาบันวิจัยข้าวนานาชาติ (IRRI) เพื่อระดมความคิดในการพัฒนาข้าว C4 (Sheehy et al., 2007) ซึ่งได้มีการนำเสนอ 2 แนวทางคือ แบบเซลล์เดียว (single-cell model) และแบบสองเซลล์ (two-cell model)
Single-cell model: การสังเคราะห์แบบเกิดขึ้นภายในเซลล์เดียวนี้ได้ถูกแนะนำครั้งแรกในปี 1990 (Burnell, 1990) ในแบบนี้ส่วนของ cytosol และคลอโรพลาสต์จะทำหน้าที่เลียนแบบเซลล์ M และเซลล์ BSของพืช C4 เอนไซม์ CA และ PEPC จะต้องแสดงออกใน cytosol และ PPDK กับเอนไซม์ที่ใช้ในการ decarboxylation กรด C4 ต้องให้แสดงออกในคลอโรพลาสต์ สิ่งที่น่าดึงดูดใจของโมเดลนี้คือความเรียบง่ายของการออกแบบเมื่อเปรียบเทียบกับโมเดลชนิดสองเซลล์ที่ต้องการ Kranz anatomy
โมเดลแบบสองเซลล์ก็คือการสังเคราะห์แสงแบบ C4 ที่ต้องอาศัย Kranz anatomy นั่นเอง โมเดลชนิดนี้ต้องคำนึงถึงปัจจัยเกี่ยวข้องหลายประการ ความพยายามในการพัฒนาข้าว C4 ในอดีตจนถึงปัจจุบันยังไม่ได้คำนึงถึงความจริงที่ว่าเอนไซม์ที่เกี่ยวข้อง กับกระบวนการสังเคราะห์แสงนั้นถูกควบคุมด้วยกลไกการควบคุมการแสดงออกของยีน ที่มีลักษณะเฉพาะหลาย ๆ กลไก อาทิเช่น เอนไซม์ PEPC และเอนไซม์ PPDK นั้นถูกควบคุมด้วยกระบวนการ phosphorylation/dephosphorelation ที่แตกต่างกัน ในสภาวะที่มีแสง PEPC จะถูก phosphorylated ทำให้เอนไซม์มีความไวต่อการยับยั้งการทำงานของ malate และ aspartate น้อย และมีความไวต่อการกระตุ้นโดย glycine ได้มากกว่า (Izui et al., 2004) การทำให้ PEPC แสดงออกของในใบข้าว โดยที่ไม่ได้มีการทำให้เกิดการแสดงออกของ PEPC kinase และ PEPC phosphatase พร้อมกันไปด้วยนั้น ทำให้ต้นข้าวที่มีระดับการแสดงออกของ PEPC สูงได้ก็จริงแต่เป็นเอนไซม์ที่ไม่สามารถ catalyze ปฏิกิริยา PEP caboxylation ได้อย่างเต็มศักยภาพเพราะไม่ได้ผ่านการ activate ที่สมบูรณ์ ในทำนองเดียวกัน PPDK ถูกควบคุมโดยกลไก phosphorylation/dephosphorylation อันหนึ่งซึ่งตอบสนองต่อ adenylate energy charge โดยภายใต้สภาวะที่มีแสงน้อย (low light) และมี adenylate energy charge ต่ำ PPDK จะถูก phosphorylate แต่ไม่ทำงาน (inactive) เอนไซม์นี้จะถูกกระตุ้นภายใต้สภาวะที่มี adenylate energy สูง และถูก dephosphorylated (Chastain and Chollet, 2003) การทำให้ PPDK มีการแสดงออกในคลอโรพลาสต์ของใบข้าวโดยไม่มีการแสดงออกของ PPDK regulatory protein ด้วยนั้น อาจทำให้เกิด unregulated hydrolysis ของ ATP ดังนั้นการถ่ายยีน C4 เข้าสู่ข้าวโดยไม่ได้คำนึงถึงปัจจัยเหล่านี้อาจทำให้เกิดความไม่สมดุลและมี ผลในทางลบต่อการเจริญเติบโตของต้นพืช ดังเช่นในพืชที่ได้รับการถ่ายยีน NADP-ME มีสภาพแคระแกร็น (stunt) (Tsuchida et al., 2001) ในทำนองเดียวกัน Taniguchi และคณะ(2008) ได้ทำให้ PEPC และ PPDK ที่ได้จากข้าวโพด, NAPDH-ME จากข้าว, และ NADP-MDH จากข้าวฟ่างมีการแสดงออกมากขึ้นในข้าว พวกเขาพบว่า PPDK และ MDH ที่สร้างจากยีนที่ถูกส่งถ่ายเข้าไปนั้น จะมีสภาพ active เฉพาะตอนกลางวัน ในขณะที่ PEPC กับ ME มีสภาพ active ทั้งในช่วงกลางวันและกลางคืน ต้นข้าวที่การแสดงออกของ PEPC เป็นปริมาณมาก ๆ นั้น มีสภาพแคระแกร็น นักวิจัยได้แนะนำว่าอาการแคระแกร็นอาจรักษาได้หากลดปริมาณของ PEPC protein Kajala และคณะ (2011) ได้สืบค้นและสรุปประเด็นในการพัฒนาข้าว C4 โดยใช้ระบบ two-cell model ที่กำลังดำเนินการโดย C4 Rice Consortium แนวทางสองแนวทางดังกล่าวได้แก่การทำ metabolic C4 engineering และการค้นหายีนและปัจจัยควบคุมลักษณะทางกายภาพของใบโดยใช้ประชากรพืชกลาย พันธุ์ ในการทำ C4 engineering นี้ได้มีการใช้ยีนจากข้าวโพดเพื่อส่งถ่ายและให้มีการแสดงออกในข้าว ในขณะเดียวกันก็มีการยับยั้งการแสดงออกของยีนที่มีอยู่เดิมในข้าว ในการทำ C4 engineering ของโครงการ C4 Rice Project สามารถแบ่งออกได้เป็นสามขั้นตอน ในขั้นตอนแรกของโครงการจะเป็นการส่งถ่ายยีนหลัก ๆ ที่อยู่ในระบบ C4 metabolism ให้กับข้าว และให้ยีนเหล่านั้นทำงานได้ในลักษณะจำเพาะต่อเซลล์ชนิด BS หรือ M เหมือนกับที่อยู่ในพืช C4 นอกจากนี้ยังมีการยับยั้งการแสดงออกของยีนที่อยู่ในวัฏจักรคัลวินบางยีนที่ มีการแสดงออกในเซลล์ M ด้วย โดยใช้เทคนิคการยับยั้งการแสดงออกของยีนแบบ artificial microRNA (amiRNAs) ซึ่งในขณะนี้ได้มีการใช้ amiRNAs ในการยับยั้งการแสดงออกของยีน RubisCO ชนิด small subunit (RbcS) ที่อยู่ในเซลล์ M แล้ว นอกจากนี้ยังมีแนวคิดในการเปลี่ยนตำแหน่งการเกิดการหายใจเชิงแสง (photorespiration) ให้เกิดปฏิกิริยาในเซลล์ BS ในใบของพืช C3 แทนการเกิดปฏิกิริยาในเซลล์ M เพื่อให้ Rubisco ให้เซลล์ M ได้ถูกนำไปใช้ในการสังเคราะห์แสงได้อย่างเต็มที่ ในการทดสอบแนวความคิดดังกล่าวได้มีการใช้ amiRNA ที่มียีนเป้าหมายคือ glycine decarboxylase subunit H (GDC-H) เพื่อลดการแสดงออกของยีนนี้ในเซลล์ M ขั้นที่สองของโครงการคือการเพิ่มตัวขนส่ง (transporters) ที่ใช้ในการขนส่งผลิตผลในกระบวนการสังเคราะห์แสงแบบ C4 เข้าไปในข้าว เพื่อให้การขนส่งผลผลิตที่มีการสร้างขึ้นในเซลล์ M และเซลล์ BS เป็นไปได้อย่างสะดวก ตัวขนส่งเหล่านี้ได้มาจากข้าวโพดประกอบด้วย OAA/malate antiporter (OMT1), putative dicarboxylate transporters (DiT1 and DiT2) และ PEP/phosphate translocator (PPT1) และในขั้นที่สามของโครงการจะมีการเพิ่มยีนที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมโครง สร้างกายภาพของใบหรือของเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับการเกิดใบแบบพืช C4 ซึ่งยีนเหล่านี้ได้มาจากการเสนอของนักวิจัยที่ร่วมโครงการ
พฤติกรรมของยีนจาก C4 ที่แสดงออกใน C3: การถ่ายยีนที่ได้มาจากพืช C4 ที่มีความสัมพันธ์ใกล้ชิดกับยีนในพืช C3 ทำให้ยีนสามารถแสดงออกได้ใน M หรือ BS อย่างไรก็ตาม อาจจะไม่ได้ผลที่ดีเสมอไป และการใช้ยีนจากพืชตัวให้ (donor) ที่มีความห่างกันทางวิวัฒนาการกับพืชตัวรับ (recipient) อาจทำให้ยีนที่ถ่ายเข้าไปไม่เกิดการแสดงออก นอกจากนี้การใช้ยีนทั้งชิ้น (intact gene) ซึ่งประกอบไปด้วยส่วนของ 5’UTR, introns และ 3’UTR พบว่ามีการก่อให้เกิดการแสดงออกได้ในระดับที่สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับ cDNA clone
ความจำเพาะของ Mesophyll Cell ในพืช C3ทั้ง promoter รวมไปถึงยีนจากพืช C4 ที่ถอดรหัสให้ PEPC, PPDK และ aspartate aminotransferase (AspAT) ได้มีการถูกถ่ายยีนเข้าไปสู่พืช C3 และนำไปสู่การสะสมในเซลล์ M โดยดูได้จากการแสดงออกของ GUS reporter ทำให้เกิดความเข้าใจเกี่ยวกับยีน PEPC ในข้าวโพดซึ่งสามารถทำงานได้เป็นอย่างดีในข้าว โดยมีการทำงานได้เกือบจะสมบูรณ์ ซึ่งบริเวณ 5’ (-1212 ถึง +78) ของยีน PEPC ในข้าวโพดก่อให้เกิดการสะสมของ GUS reporter ในข้าว japonica ได้อย่างดีและมีการแสดงออกเมื่อถูกชักนำด้วยแสง ดังนั้น cis-element จึงมีผลโดยตรงต่อการแสดงออกอย่างจำเพาะในเซลล์ M และตอบสนองต่อแสงในข้าว การวิเคราะห์ gel-rerardation พบว่า nuclei ของข้าวมีโปรตีนที่สามารถจับกับบริเวณที่เป็น cytosine rich ของ promoter จากข้าวโพด และกิจกรรมของการจับกันนี้มีความคล้ายคลึงกับ PEP-I ในข้าวโพด เมื่อยีนที่ไม่ได้ถูกดัดแปลง (ประกอบด้วย nucleotide -1212 จากจุดที่มีการถอดรหัส, intron, และ 2.5 kb downstream ของ stop codon) ได้ถูกแทนที่ในข้าว พบว่าระดับของการแสดงออกของ PEPC เกิดได้สูงและสามารถสร้างโปรตีน PEPC ที่ทำงานได้ แสดงให้เห็นว่า ยีนข้าวโพดสามารถแสดงออกอย่างสูงได้ในข้าวและมีการถอดรหัสอย่างถูกต้อง นอกจากนี้โปรตีนที่สร้างขึ้นยังสามารถทำงานได้ด้วย อย่างไรก็ตาม บริเวณที่เกิด PEPC จะอยู่ในเซลล์ M หรือไม่นั้นยังไม่มีในการรายงาน อีกหนึ่งงานวิจัย พบว่า เมื่อยีน PEPC จากข้าวโพดได้ถูกถ่ายไปสู่ข้าว indica พบว่า จะมีการสะสมของการถอดรหัสและสร้างโปรตีนอย่างมีนัยสำคัญ และทำให้อัตราการสังเคราะห์แสงค่อย ๆ เพิ่มขึ้น ณ สภาพที่มีอุณหภูมิสูงและความเข้มของแสงที่มาก ซึ่งสิ่งเหล่านี้เกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นทีละน้อยของ stomatal conductance
การถ่ายยีน PEPC ของข้าวโพดที่ไม่ได้ถูกดัดแปลงภายใต้การควบคุมของ promoter และ terminator ของมันเอง ไปยังยาสูบ (พืช C3) จะพบการสะสมของการถอดรหัสยีน ZmPEPC โดยการชักนำของแสง แต่จุดเริ่มต้นของการถอดรหัสจะเกิดขึ้นที่ก่อนถึงจุดปกติ (normal site) และเมื่อทดลองใช้ CAB promoter ของยาสูบต่อเข้ากับยีน PEPC ของข้าวโพด พบว่า จะมีการถอดรหัสที่ถูกต้องมากขึ้นและมีนัยสำคัญต่อการเพิ่มขึ้นในกิจกรรมของ PEPC นอกจากนี้ ปริมาณ malate ในใบยังมีมากขึ้นด้วย แสดงว่า กิจกรรมของเอนไซม์ malate dehydrogenase มีเพียงพอสำหรับที่จะจัดการกับการเพิ่มขึ้นของการผลิต OAA อย่างไรก็ตาม ยังไม่เป็นที่แน่ชัดว่า construct ในยาสูบจะทำให้เกิดการสะสมของ PEPC ในเซลล์เฉพาะใดบ้าง
ยีน PPDK ของข้าวโพดภายใต้การควบคุมของ promoter และ terminator ของตัวมันเองสามารถก่อให้เกิดการสะสมของโปรตีนในข้าวได้อย่างมีนัยสำคัญ และเมื่อ promoter ของยีนPPDK ในข้าวโพด (-1032 ถึง +71) ถูกต่อเข้ากับ uidA พบว่า การสะสมของ GUS จะมีความเฉพาะเจาะจงในเซลล์ Mในสภาพที่มีแสง ซึ่ง promoter ดังกล่าวสามารถผลิต GUS ได้ปริมาณที่เล็กน้อยในเซลล์ BS ได้มีการศึกษาพฤติกรรมของ promoter ของยีน PPDK orthologs ในข้าวโพดและข้าว โดยเมื่อต่อ uidA เข้ากับทั้งยีน ZmPPDK -1325 ถึง +1211 และยีน OsPPDK-1325 ถึง +211 พบว่า จะมีความสัมพันธ์กับจุดเริ่มต้นการถอดรหัสของแต่ละยีนต่อการสะสมของ GUS ในใบเมื่อชักนำด้วยแสงในข้าว japonica อย่างไรก็ตาม บริเวณ 5’ ของข้าวโพดจะชักนำให้เกิดกิจกรรมของ GUS ได้สูงกว่า และเมื่อบริเวณ 5’ ของข้าวถูกแทนที่ด้วยข้าวโพด พบว่า เกิดการสะสมของ GUS ในเนื้อเยื่อที่สังเคราะห์แสง รวมถึง M และเซลล์BS ส่วนในบริเวณ 5’ ของข้าวของยีนที่ถอดรหัส cytosolic isoform ของ AspAT จาก Panicum miliaceum จะนำไปสู่การชักนำของแสงและมีการสะสมที่เฉพาะเจาะจงในเซลล์เมโซฟิลล์
จากการศึกษาทั้งหมดนี้ แสดงให้เห็นว่า จำนวนของ promoter จากยีนของพืช C4 สามารถชักนำให้เกิดการแสดงออกใน M-specific ของข้าวได้ ซึ่ง promoter เหล่านี้ได้ถูกใช้ในการขับเคลื่อนการแสดงออกของ exogenous uidA reporter ซึ่งจะเหมือนกับ trans-factor แสดง positive หรือ negative regulator ใน M และเซลล์ BS ตามลำดับ มากกว่าที่จะเป็น posttranscriptional degradation ในเซลล์BS
ความจำเพาะของ Bundle Sheath Cell ในพืช C3: ความเข้าใจในหน้าที่ของโปรตีนที่ต้องการในเซลล์BSของพืช C4 สามารถนำมาใช้ในการดัดแปลงพันธุกรรมในพืช C3 โดยพื้นฐานของการศึกษา promoter ของยีนที่ถอดรหัสให้ PEPCK, NADP-ME, AspAT, SSU และ P subunit ของ glycine decarboxylase โดยบริเวณ 5’ ของยีน PCK ใน Zoysia japonica ที่ถอดรหัสได้ PEPCK (-1447 ถึง +227 ที่ประกอบด้วย 5’ UTR, exon แรก, intron แรก และบางส่วนของ exon ที่สอง) ต่อกับ uidA ก่อให้เกิดการสะสมของ GUS ในเซลล์BSของข้าวPost-translational Modifications: การศึกษาในข้าวแสดงให้เห็นว่าการปรับเปลี่ยนกระบวนการหลังการแปลรหัส (post-translational) ของโปรตีนจากข้าวโพดเกิดขึ้น แต่จะให้ผลที่ไม่สม่ำเสมอด้วยการควบคุมของ endogenous ในข้าวโพด ตัวอย่างเช่น โปรตีน PPDK ของข้าวโพดถูกควบคุมด้วยแสงสว่างและมืดในข้าว แสดงให้เห็นว่า PPDK regulatory protein ของข้าวมีปฏิกิริยากับ PPDK ของข้าวโพดอย่างเหมาะสม อย่างไรก็ตาม แม้ว่า PEPC ของข้าวโพดจะถูกควบคุมผ่านกระบวนการ photorespiration ในข้าว ซึ่งการกระตุ้นโปรตีนโดย photorespiration จะเกิดขึ้นในที่มืด ขณะที่ในข้าวโพดจะเกิดขึ้นในที่สว่าง ดังนั้นผลดังกล่าวจึงเป็นจุดวิกฤตในการที่จะถ่ายทอดลักษณะ C4 เข้าไปยังพืช C3 เพราะว่า photorespiration ของ PEPC ไม่ได้ถูกพิจารณาให้เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับอัตราการสังเคราะห์แสงที่สูงใน F. bidentis
ความพยายามในการเปลี่ยน Mesophyll Cells ของพืช C3 ไปเป็น Single-Cell C4:
ความ คิดดังกล่าวอยู่บนพื้นฐานของการเริ่มต้นการค้นพบที่ว่าวัฏจักร C4 ของสิ่งมีชีวิตเซลล์เดียว (single-cell) ถูกพบใน aquatic macrophytes ซึ่งพบในตระกูลของ Hydrilla และ Orcuttia การสังเคราะห์แสงแบบ C4 ของสิ่งมีชีวิตเซลล์เดียวถูกพบและศึกษาใน Suaeda aralocaspica และ Bienertia cycloptera โดยยีน PEPC จาก Cornyebacterium glutamicum, Escherichia coli, F. trinervia และ Synechococcus vulcanus ได้ถูกถ่ายไปสู่ยาสูบ และ Arabidopsis ภายใต้การควบคุมของ CaMV35S promoter ยีนเหล่านี้ได้ถูกเลือกหรือดัดแปลงให้เป็น post-translational phosphorylation ซึ่งไม่เหมือนกับกิจกรรมของเอนไซม์ที่ downregulate ทั้งยีนของ F. trinervia และ E. coli นำไปสู่การเพิ่มขึ้นสองเท่าในกิจกรรมของ PEPC เมื่อเปรียบเทียบกับ wild type ในขณะที่ยีนจาก C. glutamicum มีกิจกรรมเพิ่มขึ้นถึง 5 เท่า แม้ว่าพืชดัดแปลงพันธุกรรมเหล่านี้มีกิจกรรมของ PEPC และปริมาณ malate ในใบที่เพิ่มขึ้น แต่ยังมีการสังเคราะห์แสงและการเจริญเติบโตในอัตราที่ต่ำ การเจริญเติบโตในอัตราที่ต่ำนี้น่าจะมีสาเหตุมาจากการเพิ่มขึ้นของการหายใจ ที่ผลิต OAA หรือ malate ภายในวัฏจักร TCA อีกหนึ่งงานวิจัย เมื่อยีน PEPC จากมันฝรั่งถูกดัดแปลงให้ลดผลกระทบอันเนื่องจากการยับยั้งโดย malate พบว่า flux จาก 14CO2 หลังจากใส่เข้าไปยัง malate จะมีปริมาณที่มากขึ้นและมีกิจกรรมที่มีสหสัมพันธ์กับจำนวนโปรตีน PEPC อย่างไรก็ตาม การแสดงออกที่เกี่ยวข้องนำไปสู่การลดการเจริญเติบโตและผลผลิตของหัวมัน ฝรั่ง เนื่องจากคาร์บอนจะถูกจับโดย PEPC ทำให้เกิดกรดอินทรีย์และกรดอะมิโนที่ใช้หายใจในวัฏจักร TCA
การศึกษา PEPC จาก S. vulcanus พบว่า มีความเข้มข้น (intensitive) ต่อ feedback inhibition ณ pH ตามธรรมชาติ และพบว่าน่าจะมีส่วนในการหลีกเลี่ยงกิจกรรมการยับยั้ง allosteric ภายใต้การควบคุมของ CaMV35S promoter การวิจัยใน Arabidopsis พบว่า การเพิ่มขึ้นของ PEPC จะทำให้เกิดใบซีดหรือยับยั้งการพัฒนาของใบและปรากฏเป็นช่องทางของ carbohydrate skeleton จากการสังเคราะห์ aromatic amino acid ไปใน glutamine, asparagines และ arginine ซึ่งเกี่ยวข้องกับวัฏจักร TCA
ความพยายามในการทำให้เกิดการเพิ่มพูนของ NADP-ME ในข้าว ได้มีการทดลองใช้ CAB promoter ของข้าวในการขับเคลื่อน cDNA ที่ถอดรหัสให้ NADP-ME จากข้าวโพดและข้าว พบว่า ยีนจากข้าวโพดทำให้มีกิจกรรมเพิ่มขึ้น 20 ถึง 70 เท่าเมื่อเปรียบเทียบกับตัวควบคุม (control) ในขณะที่ยีนจากข้าวทำให้เกิดการยับยั้งร่วมกัน จากการวิเคราะห์ immunochemistry แสดงให้เห็นว่า สายพันธุ์ที่ได้รับยีนจากข้าวโพดนั้น NADP-ME จะพบใน chloroplast นอกจากนี้ปริมาณคลอโรฟิลล์และกิจกรรมของ PSII มีสหสัมพันธ์ทางลบกับกิจกรรมของ NADP-ME การเปลี่ยนแปลง redox ใน BS chloroplast เกิดเนื่องจากอัตราการเพิ่มขึ้นของ decarboxylation ใน BS chloroplast ที่อาจจะไปเปลี่ยนแปลงปริมาณคลอโรฟิลด์และชั้นของ thylakoids ซึ่งพบใน NADP-ME type species
การศึกษาโดยใช้เอนไซม์ decarboxylase ที่แตกต่างกัน ถูกใช้ในการสร้าง (build up) วัฏจักร C4 ให้สมบูรณ์ขึ้นใน mesophyll ของพืช C3 ระบบที่ง่ายคือการทำให้พืชมี PEPC ใน cytosol และมี PEPCK (normal cytolic) และ PPDK ใน chloroplast การศึกษา stacking transgene มีพื้นฐานจากการทำซ้ำของ biochemistry associated ด้วย subtype ของ NADP-ME ในเซลล์เมโซฟิลล์ของข้าว เริ่มต้นจาก cDNA ที่ถอดรหัส PEPCK จาก Urochloa panicoides ถูกถ่ายเข้าไปสู่ข้าวและมีเป้าหมายที่ chloroplast โดยใช้ SSU transit peptide พบว่า ต้นข้าวเหล่านี้มีกิจกรรมของ PEPCK ที่สูงและเป็นที่น่าแปลกใจ เมื่อ 14CO2 ได้ถูกส่งไปยังใบ มากกว่า 20% ของ radio label และถูกรวบรวมไปยัง four-carbon compound เมื่อเปรียบเทียบกับ wild type ซึ่งเกิดขึ้น <1% แสดงให้เห็นว่า PEPCK ที่อยู่ใน chloroplast ทำให้เกิดวัฏจักร C4 ขึ้นบางส่วนในเซลล์เมโซฟิลล์ของข้าว อย่างไรก็ตาม การเปลี่ยนแปลงชีวเคมีที่แท้จริงของการเกิด phenotype ดังกล่าวนี้ยังไม่เป็นที่แน่ชัด งานวิจัยลำดับต่อมา ได้แก่ การนำสายพันธุ์ PEPCK ผสมกับสายพันธุ์ overexpression ของยีน ZmPEPC แต่ผลการทดลองพบว่า ต้นข้าวมีการเจริญเติบโตที่ไม่สูง และ thylaoid เกิดการขยายและการสะสมของคลอโรฟิลล์มีต่ำกว่าตัวควบคุม
การศึกษาชีวเคมีที่เกี่ยวข้องกับ NADP-ME subtype ในเซลล์เมโซฟิลล์ของข้าว โดยสายพันธุ์ที่มี PEPC และ PPDK ปริมาณสูงถูกผสมพันธุ์กัน จากนั้น cDNA สำหรับการสร้างเอนไซม์ malate dehydrogenase และ NADP-ME ได้ถูกเพิ่มเข้าไป พบว่า สายพันธุ์ single transgenes มีอัตราของการสังเคราะห์แสงที่เปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อยและมีนัยสำคัญต่อ phenotype คือ เกิดลักษณะต้น stuning และ chlorosis ซึ่งเกี่ยวข้องกับ overexpression ของ NADP-ME โดยข้าวดัดแปลงพันธุกรรมมีการเปลี่ยนแปลงอัตราการสังเคราะห์แสงที่ไม่มาก และไม่มีพบว่ามีความเข้มข้นของ CO2 รอบ ๆ RuBisCO
